Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Resumen

Carcinoma asociados fibroblastos (CAF), rica en miofibroblastos presentes en el estroma tumoral, juegan un papel importante en la conducción de la progresión del tumor. Hemos desarrollado un modelo de tumor coimplantation xengraft para generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos humanos mamarios. El protocolo describe cómo establecer miofibroblastos CAF que adquirir la capacidad de promover la génesis tumoral.

Resumen

Los carcinomas son los tejidos complejo compuesto por células neoplásicas y un compartimento no canceroso conocido como el "estroma". El estroma está formado por la matriz extracelular (MEC) y una variedad de células mesenquimales, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, pericitos y leucocitos ^1-3.

El estroma asociado al tumor es sensible a importantes señales paracrinas liberada por las células de carcinoma vecinos. Durante el proceso de la enfermedad, a menudo se convierte en el estroma poblada por carcinoma asociado a los fibroblastos (CAF), incluyendo un gran número de miofibroblastos. Estas células han sido previamente extraídos de diferentes tipos de carcinomas humanos para su cultivo in vitro. Una subpoblación de CAF se distingue a través de su regulación de la actina de músculo liso α-(α-SMA) la expresión de ^4,5. Estas células son un sello de "fibroblastos activados" que comparten propiedades similares a miofibroblastos commonly observada en los tejidos dañados y fibrosis ^6. La presencia de este subgrupo miofibroblástico CAF está muy relacionada con tumores malignos de alto grado y se asocia con mal pronóstico en los pacientes.

Muchos laboratorios, incluido el nuestro, han demostrado que la CAF, cuando se les inyectó células de carcinoma en ratones inmunodeficientes, son capaces de promover la génesis tumoral sustancial ^7-10. CAF preparado a partir de pacientes con carcinoma, sin embargo, con frecuencia sufren senescencia durante la propagación de la cultura limitar la extensión de su uso a través de la experimentación en curso. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado una nueva técnica para generar experimentalmente inmortalizado humanos líneas de células mamarias CAF (exp-CAF) a partir de fibroblastos humanos de mama, con un pecho coimplantation modelo de xenoinjerto tumoral.

Con el fin de generar exp-CAF, los padres fibroblastos de mama humano, procedente de los tejidos mamoplastia de reducción, fueron los primeros immortalised con hTERT, la subunidad catalítica de la telomerasa holoenzyme, y para expresar las buenas prácticas agrarias y un gen de resistencia a la puromicina. Estas células fueron coimplanted con células MCF-7 humanas de carcinoma de mama que expresan un oncogén ras activado (MCF-7-ras células) en un xenoinjerto de ratón. Después de un período de incubación in vivo, el primer inyectado fibroblastos humanos mamarios se extrajeron de los xenoinjertos de tumores en la base de su resistencia a la puromicina ^11.

Hemos observado que el residente de fibroblastos humanos mamarios se han diferenciado, la adopción de un fenotipo tumoral miofibroblástico y adquirió propiedades que promueven durante el curso de la progresión del tumor. Es importante destacar que estas células, que se define como exp-CAF, imitan el fenotipo de promoción tumoral miofibroblástico de CAF aislado de los carcinomas de mama disecados de los pacientes. Nuestra xenoinjerto de tumor derivado de exp-CAF por lo tanto, proporcionar un modelo eficaz para estudiar la biología de la CAF en breas humanost carcinomas. El protocolo descrito también se puede extender para la generación y caracterización de diferentes poblaciones CAF derivados de otros tipos de carcinomas humanos.

Protocolo

1. Aislamiento de los principales cultivos fibroblastos humanos mamario normal

Los procedimientos experimentales para aislar los fibroblastos humanos primarios cultivados mamario normal se describen en la figura. 1A.

1. Prepare el buffer de disociación celular, como se describió anteriormente ^12: Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FCS), penicilina-estreptomicina (200 unidades / ml), la colagenasa tipo I (1 mg / ml) y hialuronidasa ( 125 unidades / ml).
2. Lavar el tejido del seno disecados de una mamoplastia de reducción (~ 0.5 gramos) varias veces en tampón fosfato salino (PBS)....

Discusión

La falta de marcadores específicos de la CAF y el nivel de heterogeneidad observada entre CAF hacer la caracterización de este tipo de células por sí un desafío. CAF estudiar in vitro también se ha visto obstaculizado por la complicación adicional de que estas células envejecen y dejan de proliferar en cultivo durante un largo período. Nuestro intento anterior para inmortalizar directamente CAF primario utilizando un retrovirus construir hTERT cDNA no tuvo éxito. Por lo tanto, a investigar más a fondo el tumor .......

Materiales

Nombre del Material	Tipo	Empresa	Número de catálogo	Comentario
DMEM		Invitrogen	61965-026
Suero fetal bovino		GIBCO	10270
Penicilina-estreptomicina		Invitrogen	15140-122
Colagenasa tipo I		Sigma	C0130-1G
hialuronidasa		Sigma	H4272
Vimentina (V9) de anticuerpos		Novocastra Laboratorios	NCL-L- VIM-V9
Tenascina C (AC-8) de anticuerpos				un regalo de Dr. Luciano Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) de anticuerpos		Sigma	C6198
Prolil-4-hidroxilasa		Dako	M0877
(5B5) de anticuerpos
El colágeno tipo 1 1A anticuerpos		Sigma	HPA011795
Pan-citoqueratina de anticuerpos		Sigma	C5992
Anticuerpo de fibronectina		BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (fibroblastos proteína-1 específicos) de anticuerpos		Dako	A5114
Fibroblastos proteína de la superficie (Clon 1B10) de anticuerpos		Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP construir				Solicitud a los autores de la
pBabe-puro construir				Compra de Addgene
Puromicina		Sigma	P8833
DAPI		Sigma	D9564
Tubo cónico de 15 ml		Corning	430766
Ratón desnudo		Taconic	NCRNU-F	Mujer desnuda NCR
C3H/10T1/2 células		ATCC		CCL-226