Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Resumen

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Resumen

Hay una gran necesidad insatisfecha de un clínicamente adecuado de las células neuronales de origen humano, para la reparación o regeneración de los daños del sistema nervioso central (SNC) la estructura y los circuitos en la industria actual de la salud. Terapias basadas en células son una gran promesa para restaurar el tejido nervioso y la función de pérdida para los trastornos del sistema nervioso central. Sin embargo, las terapias basadas en células en el SNC derivan las células madre neurales se han encontrado con restricción de la oferta y la dificultad para utilizar en la práctica clínica debido a su capacidad de expansión limitada de la cultura y la plasticidad no después de un extenso ^1-3 pases. A pesar de algunos resultados beneficiosos, en el sistema nervioso central derivado de las células madre humanas neuronales (hNSCs) parecen ejercer sus efectos terapéuticos principalmente por su no neuronales a través de progenies tróficos producción y moléculas neuroprotectoras para rescatar a las células endógenas ^1-3. Por otra parte, pluripotentes células madre embrionarias humanas (hESCs) ofrecer la cura para una amplia gama de trastornos neurológicos por supplying de la diversidad de tipos de células neuronales humanas en el desarrollo del SNC para la regeneración de ^1,4-7. Sin embargo, la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de hESCs pluripotentes de manera eficiente y previsible a un fenotipo deseado ha sido un gran reto tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica. Los enfoques convencionales se basan en múltiples linajes de células pluripotentes inclinación a través de la diferenciación espontánea capa germinal, dando lugar a ineficiencia e incontrolable linaje compromiso de que a menudo es seguida por la heterogeneidad fenotípica y la inestabilidad, por lo tanto, un alto riesgo de carcinogénesis ^07.10. Además, sin definir los suplementos biológicos extranjeros / animal y / o alimentadores que han sido tradicionalmente utilizados para el aislamiento, la expansión y diferenciación de hESCs puede hacer uso directo de tales células especializadas injertos en pacientes con problemas ^11-13. Para superar estos obstáculos, hemos resuelto los elementos de un sistema de cultivo definido necesaria y suficiente para sustaining la pluripotence epiblasto de hESCs, sirviendo como una plataforma para la derivación de novo de hESCs clínicamente adecuado y eficaz dirección de hESCs tal manera uniforme hacia linajes clínicamente relevantes por pequeñas moléculas ¹⁴ (véase un esquema en la Fig. 1.). El ácido retinoico (RA) no induce la diferenciación neuronal de hESCs indiferenciada mantiene en los alimentadores ^{1, 14.} Y a diferencia de los CES del ratón, el tratamiento de células madre diferenciadas-cuerpos embrioides (EBS) sólo aumenta ligeramente el bajo rendimiento de las neuronas ^{1, 14, 15.} Sin embargo, después de evaluar una variedad de pequeñas moléculas y factores de crecimiento, se encontró que tales condiciones definidas prestados ácido retinoico (RA) es suficiente para inducir a la especificación de neuroectodermo directa de hESCs pluripotentes que más progresó a los neuroblastos que generó humanos progenitores neuronales y neuronas en el SNC en desarrollo con alta eficiencia (Fig. 2). Hemos definido las condiciones para la inducción de neuroexplosiones directas de hESCs pluripotentes sin la intervención de múltiples etapas linaje cuerpo embrioides, lo que permite un buen control de derivación eficiente de una gran cantidad de células neuronales humanas en todo el espectro de las etapas del desarrollo de terapias basadas en células.

Protocolo

1. Solución y preparación de los medios de comunicación

1. Solución de revestimiento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina en _ddH2O, autoclave y se almacena a 4 º C.
2. Matrigel recubrimiento soluciones. Solución de archivo: lento deshielo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante la noche, añadir 10 ml de helado de DMEM o DMEM/F12, mezclar bien y alícuota de 1 ml / tubo por debajo de campana esterilizada cultivo de tejidos, almacenar a -20 ° C. Solución de trabajo: descongelación lenta 1 ml alícuota Matrigel a 4 ° C durante 1-2 horas, la transferencia de 14 ml DMEM frío o DMEM/F12 y mezcle bien bajo campana de cultivo de tejidos esterilizados inmediatamente antes del revestimiento.
3. Humanos laminina solución de recubrimiento: diluir 1 ml de solución humana laminina (0,5 mg / ml en Tris Buffered NaCl, almacenar a -80 ° C, descongelación lenta a 4 ° C durante 1-2 horas) con helado de DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml de solución de trabajo (40 pg / ml) bajo campana de cultivo de tejidos esterilizados inmediatamente antes del revestimiento.
4. El crecimiento de las soluciones madre de los factores (500-1000X): disolver el factor de crecimiento de 10 mg/ Ml en tampón esterilizada (0,5% de BSA, 1,0 mM DTT, 10% de glicerol, 1XPBS) y almacenar desde 50 hasta 100 l / tubo de alícuotas a -80 ° C.
5. Todo-trans-retinoico solución de trabajo (1000X): 10 mM en DMSO, almacenar en alícuotas a -80 ° C.
6. Los medios de comunicación HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO reemplazo de suero (20%), L-alanil-L-gln o L-Gln (2 mM), MEM aminoácidos no esenciales (MNAA, 1X), y β-mercaptoetanol (100 M), se filtra y se almacena a 4 ° C, suplementado con 20 ng / ml de bFGF antes de su uso. O sustitución de "knock out (KO) de suero de reemplazo" con los componentes definidos: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM esencial aminoácidos (MEAA, 1X), y β-mercaptoetanol (100 M), se filtra y se almacena a 4 ° C, complementados con bFGF (20 ng / ml), la insulina humana (20 mg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humanos activina A (50 ng / ml), la albúmina humana / Albumax (10 mg / ml), y la transferrina humano (8 mg / ml) antes de su uso.
7. NSC los medios de comunicación: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), heparina (8 mg / ml).

2. Placa de recubrimiento

1. Placas de capa con la gelatina: añadir 2,5 ml / pocillo de solución de gelatina al 6 placas e incubar durante la noche en un 37 ° C humidificado incubadora.
2. Placas de capa con la laminina: chill recubiertos de gelatina y remover las placas de gelatina, añadir 2,5 ml / solución de revestimiento de laminina y Matrigel o humanos que trabajan para pre-enfriado gelatinizado placas de 6 pocillos y se incuba a 4 ° C durante la noche.

3. Pases y siembra hESCs indiferenciado bajo condiciones definidas

1. Permita que las colonias de células madre crecen hasta 5-7 días de edad, y tener la placa de células madre a la cultura de microscopio de disección (pre-calentar la disección de la etapa a 37 ° C) por debajo de la disección de campana esterilizada.
2. Seleccione colonias células madre se dividan. Morfológicamente, estas colonias deben tener> 75% hESCs indiferenciadas (células pequeñas y compactas), por lo general ligeramente opaca (no blanca amontonada células no, claro-las células diferenciadas) con el borde de la ONU definederneath el microscopio de disección. Cuidado esquema de las colonias seleccionadas y eliminar la capa de fibroblastos diferenciados que rodea la colonia y todas las partes diferenciadas (si existe) de la colonia con el borde de la punta P2 pipeta o tirado capilares de vidrio. (Tenga en cuenta que hESCs pluripotentes están en una etapa transitoria, someterse a la diferenciación espontánea, incluso en condiciones óptimas, aunque prefiere, es difícil para las células tesis determinar son 100% indiferenciado bajo el microscopio de disección,> 75% no diferenciado se consideran generalmente como el punto de pasar. El células diferenciadas por lo general no las semillas y seguir creciendo, eliminado en el proceso de pases)
3. Retire el papel viejo que contenga flotante células diferenciadas separadas por aspiración. Lavar con los medios de comunicación células madre (sin bFGF) una vez. Añadir 3 ml / media células madre y fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF.
4. Cortar las colonias células madre indiferenciadas en trozos pequeños, y separar con la punta de pipeta estéril o un vaso tirado capilar.
5. Piscina los medios de comunicación que contiene piezas sueltas de colonias en un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa una vez con 1 ml / medios de comunicación, así células madre que contiene 20 ng / ml de bFGF y la piscina juntos.
6. Aspirar la solución de Matrigel o laminina humanos de las nuevas placas recubiertas. Alícuota de 4 ml / así los medios de comunicación células madre que contiene piezas de colonias en una placa de 6 pocillos. Suavemente la placa de transferencia a la incubadora sin agitar y permitir que la colonia de semillas piezas durante la noche sin molestar a humidificado en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO _2.

4. Inducción neural de hESCs el marco del Sistema de cultivo definido con ácido retinoico

1. En el día 3 después de la siembra, eliminar la mayor parte de los antiguos medios de cada pocillo de la placa y dejar los medios de comunicación suficiente para permitir que las colonias de células madre que se sumerge (nunca permita que hESCs se seque). Reemplazar con 4 ml / media células madre y fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF y 10 M de ácido retinoico.
2. Reemplazar los viejos medios con los medios de células madre fresco que contiene 20 ng / ml y bFGF10 M de ácido retinoico cada dos días, y permitir neuronales inducidas por las colonias de células madre crecen hasta el día 7 u 8. Todas las células dentro de la colonia va a sufrir cambios de la morfología de grandes células diferenciadas que se siguen multiplicando. Las colonias aumentarán de tamaño para cubrir el plato el día 7 u 8, y las células comienzan a acumularse en algunas zonas de las colonias.

5. La diferenciación neuronal continua en cultivo en suspensión

1. Tome la placa de células madre a la cultura de microscopio de disección (pre-calentar la disección de la etapa a 37 ° C) por debajo de la disección de campana esterilizada. Cuidado esquema de las colonias y retirar la capa de fibroblastos que rodean la colonia (las células diferenciadas emigraron de la colonia) con el borde de la punta P2 pipeta estéril o se tira capilar de vidrio.
2. Eliminar los viejos medios que contienen células de fibroblastos flotante desprendido por aspiración. Lavar con los medios de comunicación células madre (sin bFGF) una vez. Añadir 3 ml / medios de comunicación y nuevas células madre (sin bFGF).
3. Cortar la neuro-icolonias nduced células madre en trozos pequeños, y separar con la punta de pipeta estéril o se tira capilar de vidrio.
4. Piscina los medios de comunicación que contiene piezas sueltas de colonias en un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa una vez con 1 ml / medios de comunicación y células madre (sin bFGF) y la piscina juntos.
5. Alícuota de 4 ml / pocillo medio libre de suero células madre que contiene piezas de colonias en una placa de ultra bajo de 6 pocillos y se incuban en apego a 37 ° C humidificado incubadora para permitir la flotación grupos celulares (neuroblastos) para formar durante 4-5 días.

6. Maduración fenotipo neuronal en la cultura adhesiva

1. Piscina los medios de comunicación que contiene los neuroblastos flotando en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación antiguos como todo lo que pueda y agregue la misma cantidad de nuevos medios de comunicación NSC contienen VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), y el BDNF (10 ng / ml).
2. Pipeta de arriba a abajo para mezclar neuroblastos flotante y alícuota de 4 ml / pocillo para placas de 6 pocillos. Los neuroblastos también puede ser en síEDED en un polimerizado laminina / colágeno (Matrigel) o laminina humana en 3 dimensiones de la matriz en el medio libre de suero que contiene NSC VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), y el BDNF (10 ng / ml) . La transferencia de las placas a un 37 ° C humidificado incubadora para permitir que los neuroblastos de adjuntar toda la noche.
3. Vuelva a colocar NSC medios que contienen VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) y BDNF (10 ng / ml) cada dos días. Una extensa red de soporte de las neuritas las células neuronales y células pigmentadas comenzarán a aparecer dentro de 2 semanas de cultivo continuo y aumento en el número con el tiempo, y podría ser sostenido por más de 3 meses.

7. Los resultados representativos:

El ácido retinoico (RA) se vuelve suficiente para inducir hESCs mantiene en el sistema de cultivo definido para la transición de la pluripotencia exclusivamente a un fenotipo neuroectodérmico (Fig. 2A). Tras la exposición de hESCs indiferenciada a la AR, las células dentro de la colonia va a sufrir cambios en la morfologíagrandes células diferenciadas que dejen de expresar pluripotencia asociada a marcadores, como se indica en octubre-4, y comenzar a expresar diversos asociados neuroectodermo-marcadores, como HNK1, AP2 y TrkC (Fig. 2B). Estas células diferenciadas grandes se siguen multiplicando y las colonias aumentarán de tamaño, procediendo de manera espontánea para expresar el marcador temprano neuronal β-III-tubulina (Fig. 2B). El marcador neuronal más maduro Mapa-2 comenzará a aparecer en las zonas de las colonias donde las células se han acumulado (Fig. 2B). Coincide con la aparición de las células neuroectodérmico y diferenciación neuronal, el factor específico neuronal transcripcional Nurr1, implicados en la diferenciación neuronal dopaminérgica y la activación de la tirosina hidroxilasa (TH) gen ^16, se translocan al núcleo (Fig. 2B). Después individual, el RA-hESCs tratados formarán grupos celulares flotante (neuroblastos) en un culto a la suspensiónUre para continuar con el proceso de diferenciación neuronal. Tras la eliminación de bFGF y después de permitir la neuroblastos para conectar a una placa de cultivo de tejidos o sembradas en un polimerizado laminina / colágeno en 3 dimensiones de la matriz en un medio libre de suero definido, β-III-tubulina y MAP-2 que expresan, las neuritas de soporte de las células y las células pigmentadas comenzarán a aparecer con un aumento drástico en la eficiencia, en comparación con espontánea multi-linaje diferenciación de hESCs sin tratamiento en el mismo período de tiempo, y podría ser sostenido por más de 3 meses (Fig. 2C).

Figura 1 un esquema de un buen control de inducción eficiente de las células madre pluripotentes exclusivamente a un linaje particular clínicamente relevantes por la simple provisión de moléculas pequeñas.

Figura 2 (A) Esquema que muestra de la línea de tiempo del protocolo de diferenciación neuronal de hESCs dirigido. (B) Tras la exposición de hESCs indiferenciada con el ácido retinoico (RA) en el sistema de cultivo definidos, gran diferencia octubre-4 (rojo), las células negativas dentro de la colonia comenzaron a surgir, en comparación con el modelo de tratado (DMSO) hESCs como el control . RA inducida por las células diferenciadas octubre-4-negativos comenzaron a expresar HNK-1 (rojo), AP-2 (rojo), TrkC (verde), y β-III-tubulina (rojo), de conformidad con principios de diferenciación neuroectodérmico. Estas células continuado madurando en última instancia, que expresan el marcador neuronal MAP-2 (verde), por lo general en áreas donde las células empezaron a acumularse. Coincide con la aparición de las células neuroectodérmico y diferenciación neuronal, el factor de transcripción específico neuronal Nurr1 (verde), implicados endiferenciación neuronal dopaminérgica y la activación de la tirosina hidroxilasa (TH) de genes, translocación al núcleo. Todas las células se muestran con DAPI de sus núcleos (azul). (C) tratamiento de la AR induce la diferenciación hacia un linaje neuronal con una alta eficiencia según la evaluación de extensas redes de neuritas de soporte de las células que expresan β-III-tubulina (rojo) y MAP-2 (verde, que se muestra en una matriz de 3 dimensiones). Las flechas indican las células pigmentadas típico de los del sistema nervioso central. Todas las células se muestran con DAPI de sus núcleos (azul) en las inserciones. Las barras de escala: 0,1 mm.

Discusión

Uno de los mayores desafíos tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica ha sido la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de pluripotentes células madre humanas a un fenotipo deseado de manera eficiente y predecible. A pesar de estas células pueden diferenciarse espontáneamente in vitro en células de todas las capas germinales por pasando por una etapa de agregado de varios linajes, sólo una pequeña fracción de las células de perseguir un ^1,4 linaje dado. En los agregados de células madre derivadas-, la aparición simultánea de una cantidad considerable de tipos de células muy divergentes no deseados que pueden residir en tres capas germinales embrionarias a menudo hace que la aparición de fenotipos deseados no sólo ineficiente, sino incontrolable y poco fiable así. A pesar de los linajes cardíacos y neurales se han obtenido en los informes anteriores, sin embargo, la ineficiencia en la generación de células especializadas a través de la capa germinal de la inducción de células pluripotentes y el alto riesgo de carcinogénesis siguientes transplantation han dificultado la traducción de otro ensayo clínico.

La líneas de células madre inicialmente se derivaron y mantenerse en co-cultivo con fibroblastos de ratón de crecimiento arrestado embrionarias (MEFs) ^4. Aunque varias de alimentación humana, alimentación libre-, y químicamente formulado sistemas de cultivo se han desarrollado para hESCs ^11-13, los elementos necesarios y suficientes para el sostenimiento de la auto-renovación de las células pluripotentes humanas siguen sin resolverse. Estas células alimentadoras exógenos y reactivos biológicos ayudan a mantener el crecimiento estable a largo plazo de hESCs indiferenciada, mientras que la máscara de la capacidad de las células pluripotentes para responder a las señales de desarrollo. El mantenimiento de hESCs indiferenciada en un sistema de cultivo definido biológicos sin que permite la expansión y diferenciación de fieles directa controlable es una de las claves de su utilidad terapéutica y potenciales. RA no era suficiente para inducir la diferenciación neuronal de hESCs indiferenciada mantenido bajo Condit previamente informadoiones que contienen células exógenas de alimentación. A pesar de los linajes neuronales aparecen en una etapa relativamente temprana en la diferenciación de células madre, el tratamiento de células madre diferenciadas-multi-linaje de los agregados (cuerpos embrioides) con AR sólo aumentó ligeramente el bajo rendimiento de las neuronas ^{1, 14, 15.} A fin de lograr de manera uniforme la conversión de las células madre pluripotentes a un linaje particular, se empleó un sistema de cultivo definido capaz de asegurar la proliferación de hESCs indiferenciada para identificar las condiciones para un buen control de inducción eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente a un determinado linaje clínicamente relevantes por la simple provisión de pequeñas moléculas (Fig. 1, fig. 2). Los estudios futuros se muestran las moléculas de control genético y epigenético en el desarrollo del sistema nervioso central humano como alternativa, lo que puede allanar el camino para pequeñas moléculas mediada por el control directo y la modulación de las células madre pluripotentes destino al derivar linajes clínicamente relevantes para las terapias regenerativas. RA sin tratamiento, 1-5HESCs% se someterá a la diferenciación espontánea en neuronas ^{1, 14, 15.} Con el tratamiento de la AR, hemos sido capaces de generar> 95% de los progenitores neuronales y neuronas embrionarias de hESCs mantenido bajo una cultura de definir en un proceso que podría emular el desarrollo de embriones humanos ^14. Recientemente, se conoce el destino neural-la determinación de los genes se han utilizado para transdiferenciarse fibroblastos de ratón en adultos progenitores neuronales y neuronas con una baja eficiencia que van desde 0,5 hasta 8% ^{17, 18.} Sin embargo, la reprogramación de células somáticas han sido históricamente asociada con la expresión del gen anormal y la senescencia acelerada con la utilidad terapéutica deterioro ^19-21. Finalmente, el protocolo se estableció aquí se limita a hESCs pluripotentes derivadas de la masa celular interna (ICM) o epiblasto del blastocisto humano ^4, no puede aplicarse a las células pluripotentes, incluyendo CES animal se originó, derivados de los CES a principios de mórula (ocho de las células) en fase de embriones, ²² y ArtifLas células reprogramadas icially ^23.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Gelatina	Sigma	G1890
Matrigel	BD Bioscience	356231	Factor de reducción del crecimiento
Humanos laminina	Sigma	L6274
all-trans-retinoico	Sigma	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out de reemplazo de suero	Invitrogen	10828028
MEM solución de aminoácidos no esenciales (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM unmino ácidos solución (MEAA, 100 veces)	Invitrogen	11130050
β-mercaptoetanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Ácido ascórbico	Sigma	A4403
Transferrina humana	Sigma	T8158
Humanos bFGF	PeproTech	AF-100-18B
La insulina humana	Invitrogen	12585014
Humanos activina A	PeproTech	120-14E
Humanos BDNF	PeproTech	AF-450-02
VEGF humano	PeproTech	AF-100-20
Humanos NT-3	PeproTech	450-03
Heparina	Sigma	H5284
N-2 suplemento (100X)	Invitrogen	17502048
6-y ultra placa de fijación	Corning	3471
6-y las placas	Corning	3516