Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.
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Artículo de método
Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de
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Resumen
Resumen
El campo de la investigación trofoblasto humano ayuda a comprender el complejo entorno establecido durante la placentación. Debido a la naturaleza de estos estudios, humanos en la experimentación in vivo es imposible. Una combinación de cultivos primarios, cultivos de explantes y las líneas de células del trofoblasto 1 para comprender mejor la invasión de la pared uterina 2 y remodelación de las arterias espirales uterinas por las células del trofoblasto 3,4 extravelloso (EVTS), que se requiere para el éxito del embarazo. A pesar de la riqueza de los conocimientos obtenidos de estos modelos, se acepta que en los modelos de cultivo celular in vitro utilizando EVT-como líneas celulares de pantalla alteración de las propiedades celulares en comparación con sus contrapartes en vivo 5,6. Las células cultivadas en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) mostrar las propiedades morfológicas, fenotípicas y funcionales de las líneas celulares EVT-como el que más se asemejan mucho en la diferenciación utero EVTS, con el aumento de expresión de los genes de la mediación invasión (por ejemplo, metaloproteinasas de matriz (MMP)) y la diferenciación del trofoblasto 7,8,9. El Hospital de Saint-Georges-de células placentarias Línea-4 (SGHPL-4) (donado amablemente por el Dr. Guy Whitley y la Dra. Judith Cartwright) es una línea de células EVT-como el que se utilizó para las pruebas de la RCC.
El diseño del recipiente de cultivo RCC se basa en el principio de que los órganos y tejidos en función de tres dimensiones (3-D) el medio ambiente. Debido a las condiciones de cultivo en la dinámica del buque, incluidas las condiciones de corte fisiológicamente relevantes, las células cultivadas en tres dimensiones forman agregados basados en afinidades naturales celular y diferenciarse en tejidos como organotípicos asambleas 10,11,12. El mantenimiento de una órbita fluido proporciona un bajo cizallamiento, baja turbulencia entorno similar a las encontradas en vivo. Sedimentación de las células cultivadas se ve contrarrestada por el ajuste de la rotaciónvelocidad de la RCC para asegurar una constante caída libre de las células. El intercambio gaseoso ocurre a través de una membrana permeable hidrofóbica en la parte posterior del biorreactor. Al igual que sus padres en el tejido vivo, RCC células cultivadas son capaces de responder a los químicos y los gradientes moleculares en tres dimensiones (es decir, en su superficie apical, basal y lateral), ya que se cultivan en la superficie de cuentas microportadores porosa. Cuando se cultiva en dos dimensiones monocapas sobre superficies impermeables como el plástico, las células se ven privadas de esta importante comunicación en su superficie basal. En consecuencia, las limitaciones espaciales impuestas por el medio ambiente afectan profundamente a cómo el sentido y las señales de las células de decodificar el microambiente que rodea, lo que implica un papel importante para el medio en 3-D 13.
Hemos utilizado la RCC para diseñar biológicamente significativos modelos 3-D de diversos tejidos epiteliales humanas 7,14,15,16. De hecho, muchos informes anteriores han demonstrated que las células cultivadas en el RCC puede asumir fenotipos fisiológicamente relevantes que no han sido posible con otros modelos 10,17-21. En resumen, la cultura de la RCC representa una forma fácil, reproducible y de alto rendimiento plataforma que ofrece un gran número de células diferenciadas que son susceptibles a una variedad de manipulaciones experimentales. En el siguiente protocolo, utilizando EVTS como ejemplo, que describa claramente los pasos necesarios para cultivar células en tres dimensiones adherentes en la RCC.
Protocolo
1. Preparación de bolas de colágeno
- Antes de EVTS de carga para 3-D de cultivo de células, se necesita para preparar las cuentas microportadores Cytodex-3:
- Pesar la cantidad apropiada de Cytodex-3 cuentas necesarios para el experimento. Este protocolo está adaptado para el vaso de 10 ml RCC, en la que 0,05 g de granos se necesitan. Para que un buque 50ml RCC, la escala correspondiente. En un tubo cónico de 50 ml autoclavable, mezclar 250 mg Cytodex-3 perlas con 12 ml de fosfato tamponado Dulbecco (DPBS). Esta cantidad es suficiente para 5 buques RCC.
- Asegurar un volumen adecuado está presente en el tubo cónico, como el proceso ....
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Discusión
La técnica de cultivo que aquí se presenta proporciona a los investigadores altamente invasiva EVT-como las células. Ahora se ha reconocido que la pérdida de la diferenciación se produce en monocapas debido a la inhibición de la respuesta celular a agentes químicos y señales moleculares en tres dimensiones (la superficie celular apical, basal y lateral) 10,13. Esta técnica refleja características señaladas en el útero de invadir las células EVT. Como el procedimiento convencional imita el tejido mono.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud de subvención del NIH / NICHD # HD051998 (de CAM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Cytodex microportadores cuentas | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Celular sistema de rotación Cultura (CRC) | Synthecon | RCC-D | Incluye base de rotor de suministro, la energía, 4 unidades RCC desechables |
| RCC unidades desechables | Synthecon | Contacto Synthecon | |
| 3 ml Luer-Lock punta de la jeringa | BD | 309585 | |
| 10 ml de ancho de punta de la pipeta serológica | BD | 357504 | |
| MEM Alfa | Invitrogen | 12561-072 | |
| L-15 de Leibovitz medio, en polvo | Invitrogen | 41300-039 | |
| H 2 O, endotoxinas | Pescador | MT-25-055-CM | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptona | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructosa | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactosa | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030 | |
| La insulina-transferrina-selenita de sodio (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140 |
Referencias
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.....
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Reimpresiones y permisos
