Ofrecemos una guía práctica para la entrega de los trazadores En vivo Y el uso de la vía espinocerebelosa como un sistema modelo para demostrar los pasos esenciales para el éxito del análisis del circuito neuronal en ratones. Se describe en detalle el protocolo versátil de seguimiento que explota aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con fluoróforos Alexa.
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Artículo de método
Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color
En este artículo
Resumen
Resumen
Circuitos neuronales se organizan en funcionamiento los mapas topográficos. Con el fin de visualizar la arquitectura de circuitos complejos, hemos desarrollado un enfoque para la etiqueta de forma fiable el patrón global de múltiples proyecciones topográficas. El cerebelo es un modelo ideal para estudiar la disposición ordenada de los circuitos neuronales. Por ejemplo, la organización compartimental de espinocerebelosa fibras musgosas ha demostrado ser un sistema indispensable para el estudio de los patrones de las fibras musgosas. Recientemente hemos demostrado que el germen de trigo crioaglutininas (WGA) conjugado con Alexa 555 y 488 se puede utilizar para rastrear espinocerebelosa proyecciones de las fibras musgosas en el desarrollo y los ratones adultos (Reeber et al. 2011). Se encontraron tres propiedades principales que hacen que las herramientas de Alexa WGA-trazadores deseable para el etiquetado de las proyecciones neuronales. En primer lugar, fluoróforos Alexa son intensos y su brillo permite obtener imágenes wholemount directamente después de rastrear. En segundo lugar, WGA-Alexa trazadores etiqueta de toda la trayectoria de desarrollo y adultos projectio neuralns. En tercer lugar, WGA-Alexa trazadores son transportados rápidamente en ambas direcciones, retrógrada y anterógrada. A continuación, describimos en detalle la forma de preparar los trazadores y otras herramientas necesarias, la forma de realizar la cirugía para espinocerebelosa localización y la mejor forma de proyección de imágenes trazadas en tres dimensiones. En resumen, ofrecemos un protocolo de paso a paso el seguimiento que será útil para descifrar la organización y la conectividad de los mapas funcionales, no sólo en el cerebelo, sino también en la corteza cerebral, tronco cerebral y médula espinal.
Protocolo
1. La entrega de los marcadores en vivo mediante cirugía estériles (Secciones 1.1 a 1.16)
Durante todo el procedimiento, le aconsejamos que las técnicas quirúrgicas estériles utilizar. Esto incluye el uso de guantes estériles, bata y mascarilla. Herramientas o bien deben ser esterilizados en autoclave antes del uso o de limpiar a fondo con agua y etanol. Durante la cirugía, y especialmente entre los animales, fragmentos de limpiar el tejido de las herramientas y los instrumentos de esterilización en seco con un esterilizador de cuentas en caliente (Steri 250 cat. # 18000-45, Herramientas de Bellas Ciencia). Además, es fundamental q....
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Discusión
Hemos descrito los detalles quirúrgicos y técnicas necesarias para localizar a los axones y las dendritas utilizando un nuevo enfoque basado en los fluorescentes para la rápida etiquetado proyecciones neuronales en el desarrollo y los ratones adultos. Utilizando WGA-Alexa se muestra cómo los trazadores y marcadores se pueden utilizar para el análisis de la topografía de circuitos modelados en alta resolución y en tres dimensiones.
Muchos trazadores disponibles para el rastreo de los circuito.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el investigador nuevos fondos iniciales de Albert Einstein College of Medicine de la Universidad Yeshiva de RVS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipos / Reactivos | Modelo / Número de catálogo | Empresa | |
| Esterilizador de bolas | Modelo Steri 250 gatos. # 18000-45 | Herramientas de Bellas Ciencia | |
| Cauterizador | Gato. # 18000-00 | Herramientas de Bellas Ciencia | |
| Vidrio de borosilicato capilares | Gato. # 300056 | Harvard Apparatus | |
| Dos etapas de vidrio Micropipetas Extractor | Modelo 001-PC-10 | Narishige | |
| Micrómetro jeringa | Gato. # GS-1100 | Instrumentos Gilmont | |
| Pequeños Animales de instrumentos estereotáxica | Modelo 940-A | Kopf Instrumentación | |
| Manipulador de electrodos | Modelo 960 | Kopf Instrumentación | |
| Vetcare cámara | Gato. #340508 | Harvard Apparatus | |
| Almohadilla eléctrica | Gato. # 341241 | Harvard Apparatus | |
| Leica DFC360 FX cámara | DFC360 FX | Leica | |
| Leica DFC490 cámara | DFC490 | Leica | |
| Leica DM5500 microscopio | DM5500 | Leica | |
| Leica DFC3000 FX cámara | DFC3000 FX | Leica | |
| Leica MZ16 FA microscopio | MZ16 FA | Leica | |
| CY3 filtro | Modelo # 11600231 | Leica | |
| FITC filtro | Modelo # 11513880 | Leica | |
| A4 DAPI / filtro UV | Modelo # 11504162 | Leica | |
| Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 conjugada | Gato. # W11261 | Invitrogen | |
| Trigo germ aglutinina, Alexa Fluor 555 conjugada | Gato. # W32464 | Invitrogen |
Referencias
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).....
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Reimpresiones y permisos
