Uncoating es un paso esencial en la fase temprana del ciclo de vida del VIH-1 y se define como el desmontaje de la cápside y la liberación de los complejos de ribonucleoproteína viral (vRNP). En este sentido, demostrar las técnicas para el aislamiento de los núcleos intactos del VIH-1 viriones y cuantificar sus uncoating In vitro.
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Artículo de método
En uncoating in vitro del VIH-1 Cores
En este artículo
Resumen
Resumen
El genoma de los retrovirus está encerrado en una cápside rodeado por una envoltura lipídica. Para los lentivirus como el VIH-1, la cónica cápside está compuesta de proteína CA organizó como una red de hexágono. La cápside está cerrado por siete pentámeros en la punta gruesa y 5 en el extremo estrecho del cono 1, 2. Encerrado en esta cápside se encuentra el complejo ribonucleoproteína viral, y juntos constituyen el núcleo.
Después de la fusión de la membrana viral con la membrana celular de destino, el VIH-1 es liberado en el citoplasma. La cápside se desmonta la liberación libre de CA en forma soluble 3 en un proceso conocido como uncoating. La localización intracelular y el momento del VIH-1 uncoating son poco conocidos. Solo sustituciones de aminoácidos en la CA que alteran la estabilidad de la cápside también afectar la capacidad del VIH-1 para infectar las células 4. Esto indica que la estabilidad de la cápside es fundamental para la infección VIH-1. VIH-1 uncoating ha sido difícil de estudiar debido a la falta de disponibilidad de ensayos sensibles y fiables para este proceso. Aquí se describe un método cuantitativo para el estudio de uncoating in vitro utilizando núcleos aislados de infecciosas del VIH-1 partículas. El enfoque incluye el aislamiento de los núcleos por la sedimentación de los viriones concentrada a través de una capa de detergente y en un gradiente lineal de sacarosa, en el frío. Para cuantificar uncoating, los núcleos aislados se incuban a 37 ° C durante varios intervalos de tiempo y, posteriormente, se sedimentaron por ultracentrifugación. El grado de uncoating se analiza mediante la cuantificación de la fracción de CA en el sobrenadante. Este enfoque ha sido empleado para analizar los efectos de las mutaciones virales de VIH-1 en la estabilidad de la cápside 4, 5, 6. También puede ser útil para estudiar el papel de los factores celulares del VIH-1 uncoating.
Protocolo
1. La producción de partículas de VIH-1
Antes de continuar, usted debe obtener el permiso y seguir las directrices de la oficina de Bioseguridad de la institución para trabajar en un centro de bioseguridad aprobada por el VIH infeccioso. Usted debe asegurarse de que el cuidado y las precauciones de seguridad son seguidos durante el trabajo en el laboratorio de bioseguridad.
La producción de partículas de VIH-1 se realiza típicamente mediante transfección transitoria de células 293T con el VIH-1 proviral DNA utilizando un fosfato de calcio método de transfección 7, 8. Las reservas de virus de alto títu....
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Discusión
El método descrito aquí para purificar el VIH-1 para estudiar los núcleos uncoating in vitro es útil para el estudio de esta fase del ciclo de vida del VIH-1, sobre todo debido a la falta de un método validado para analizar el VIH-1 uncoating en las células diana. Aunque este método utiliza el equilibrio ultracentrifugación para purificar los núcleos, otros han utilizado granulación directa después de la lisis breve con un 1% Triton X-100-12, 13 o granulación a través de un colchón de sacarosa recubiertos de .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
VIH-1 uncoating estudios en el laboratorio Aiken fueron apoyados por las subvenciones del NIH AI40364, AI50423 y AI076121. Varios materiales clave, como los reactivos utilizados en el p24 ELISA, fueron proporcionados por la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de referencia de la División de SIDA, NIAID, NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| DMEM | Cellgro | 10 a 013 CV | |
| PBS | Cellgro | 21 a 031 CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0,25% de tripsina-EDTA | Cellgro | 25 a 053-CI | |
| 2XBBS | Composición: 50 mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl y 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajustar el pH a 6,95a temperatura ambiente. Filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas a -20 ° C. | ||
| Anticuerpo de recubrimiento: Anticuerpo monoclonal para p24 (183-H12-5C) | SIDA de los NIH Programa de Investigación y Referencia Reactivo | 3537 | |
| Primaria de anticuerpos de VIH-Ig (suero hiperinmune paciente humano) | NIH Investigación sobre el SIDA Programa de referencia y los reactivos | 3957 | |
Anticuerpo secundario: De cabra anti-IgG humana, conjugado con peroxidasa | Atravesar | 31130 | |
| HRP sustrato | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB placas de 96 pocillos | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti SW32.1 y rotores de Ti y ultracentrífuga compatible | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 de rotor y ultracentrífuga de mesa | Beckman Coulter | ||
| Alta velocidad de los tubos de microcentrífuga | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi densidad de flujo gradiente fraccionador | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradiente de ex | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
Referencias
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature.
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Reimpresiones y permisos
