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Artículo de método

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

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DOI:

10.3791/3404

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6 de diciembre de 2011

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1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Anatomy and Cell Biology, The University of Kansas School of Medicine

En este artículo

Resumen

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

Resumen

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales quimiosensoriales que portan información sobre el estado social, sexual y reproductivo de los individuos de la misma especie 1,2. Estas señales intraspecíficas, las feromonas, así como señales de algunos depredadores 3, activan a las neuronas sensoriales vomeronasales (VSNs) con altos niveles de especificidad y sensibilidad 4. Al menos tres familias distintas de receptores acoplados a proteínas G, V1R, V2R y FPR 5-14, se expresan en las neuronas del VNO para mediar la detección de las señales quimiosensoriales. Para comprender cómo se codifica la información feromonal por el VNO, es fundamental analizar los perfiles de respuesta de neuronas VSN individuales frente a diversos estímulos e identificar los receptores específicos que median estas respuestas.

Las neuroepitelios del órgano vomeronasal (VNO) están encerrados en un par de huesos vomerinos. La estructura tubular semicerrada del VNO tiene un extremo abierto (el conducto vomeronasal) que se conecta con la cavidad nasal. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) extienden sus dendritas hacia la parte luminal del VNO, donde las señales de feromonas entran en contacto con los receptores expresados en los botones dendríticos. Los cuerpos celulares de las VSN forman capas pseudoestratificadas, con V1R y V2R expresados en las capas apical y basal, respectivamente 6-8. Se han utilizado varias técnicas para monitorear las respuestas de las VSN a estímulos sensoriales 4,12,15-19. Entre estas técnicas, la preparación de cortes agudos ofrece varias ventajas. Primero, en comparación con las VSN disociadas 3,17, las preparaciones en corte mantienen a las neuronas en su morfología nativa y las dendritas de las células permanecen relativamente intactas. Segundo, los cuerpos celulares de las VSN son fácilmente accesibles en cortes coronales del VNO, lo que permite estudios de electrofisiología y experimentos de imagen, a diferencia de las preparaciones de epitelio completo y montajes completos 12,20. Tercero, este método puede combinarse con técnicas de clonación molecular para permitir la identificación de receptores.

La estimulación sensorial provoca una fuerte entrada de Ca2+ en las VSN, lo que indica la activación del receptor 4,21. Por lo tanto, desarrollamos ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en las neuronas sensoriales olfativas, incluidas las VSN 15,22. La sensibilidad y la naturaleza genética de la sonda facilitan enormemente los experimentos de imagen de Ca2+. Este método ha eliminado el proceso de carga con colorante utilizado en estudios previos 4,21. También empleamos un sistema de administración de ligandos que permite aplicar diversos estímulos a cortes del órgano vomeronasal. La combinación de ambas técnicas nos permite monitorear simultáneamente múltiples neuronas en respuesta a un gran número de estímulos. Finalmente, hemos establecido una canalización de análisis semiautomatizada para ayudar en el procesamiento de imágenes.

Protocolo

1. Preparación de la solución

  1. Prepare soluciones 10X R1, 10X R2 y 10X R3 según la tabla.
    R1
    Productos químicosMW(g/mol)mM (1X)10X stock (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M stock110 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    NaH2PO4·H2O137.991.251.72

    R2
    Producto químicoMW(g/mol)mM (1X)10X stock (g/L)
    NaHCO384.012521

    R3
    Productos químicosMW(g/mol)mM (1X)10X stock (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M stock220 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    HEPES1 M stock550 ml
  2. Prepare 1 litro de fluido artificial cerebroespinal de ratón (mACSF) el día del experimento mezclando 100 ml de R1 10X y 100 ml de R2 10X en agua doblemente destilada (DDW) y agregue 1,8 g de dextrosa (10 mM final). Este método de preparación evita la precipitación de carbonato de calcio a pH alto. La osmolaridad del mACSF es aproximadamente 310-315 mOsm/L. Ajuste la osmolaridad con dextrosa o agua si es necesario. Sature la solución con gas Carboxygen (95 % oxígeno y 5 % dióxido de carbono) durante al menos 30 minutos antes de ajustar el pH de la solución a 7,2-7,4.
  3. Prepare 1 litro de solución de Ringer mezclando 100 ml de R2 10X y 100 ml de R3 10X en DDW y agregue 1,8 g de dextrosa (10 mM). La osmolaridad y el pH de la solución de Ringer deben ser similares a los del mACSF. Sature la solución con gas Carboxygen.
  4. Prepare agarosa de bajo punto de fusión (LMA) al 4 % en mACSF o en solución de Ringer. Fraccione la agarosa fundida en tubos eppendorf y almacénela a 4 °C hasta su uso. La LMA, compuesta por polisacárido purificado, permanece fluida a 37 °C y solidifica rápidamente a temperaturas inferiores a 25 °C. Estas propiedades la hacen ideal para embeber el órgano vomeronasal (VNO) y para experimentos de fisiología de tejido vivo. Otros materiales impuros, como el agar, no deben usarse en experimentos con tejido vivo, ya que componentes no caracterizados podrían interferir con la respuesta neuronal.
  5. Prepare los estímulos de feromonas en solución de Ringer. Para orina de ratón, una dilución 1:100 produce respuestas robustas.

2. Preparación del corte del órgano vomeronasal

  1. Antes de sacrificar al animal, coloque dos tubos de LMA en un bloque térmico y ajuste la temperatura a >60°C para fundir el agarosa. Una vez que el gel se licúe, transfiera los tubos a un bloque térmico de 37°C.
  2. Decapite un ratón G-CaMP2 tras la eutanasia con CO2. Corte los huesos mandibulares con tijeras para retirar la mandíbula inferior. Retire el tejido palatino superior acanalado para exponer la cavidad nasal (Figura 1A). Separe los maxilares insertando una hoja quirúrgica entre los dos incisivos frontales. Retire cuidadosamente los maxilares para exponer el órgano vomeronasal (VNO). En este punto, el VNO completo puede levantarse desde la cavidad nasal sujetándolo por el hueso caudal (Figura 1B). Transfiera inmediatamente el VNO a una solución fría y oxigenada de mACSF.
  3. Bajo un microscopio de disección, separe los dos VNO utilizando la punta de unas pinzas #5, deslizándola suavemente a lo largo de la pared del hueso septal (Figura 1C). Retire el hueso vomer que rodea el tejido del VNO. Levante suavemente todo el tejido del VNO desde la cavidad ósea. Se debe tener extrema precaución en este paso para no dañar el neuroepitelio. Cualquier fragmento óseo que quede en la superficie del tejido debe eliminarse completamente antes del inclusión. Los fragmentos que permanezcan en el tejido podrían quedar atrapados por la cuchilla de corte, arrastrando el tejido fuera del bloque de agarosa.
  4. Use las pinzas para sujetar el extremo posterior del tejido del VNO y sumérjalo suavemente en el agarosa fundido (Figura 1D). Enfríe rápidamente el tubo en hielo para solidificar el agarosa. El proceso de inclusión y enfriamiento debe tomar menos de 2 minutos.
  5. Se utiliza un cortador de tejidos VF300 (Precisionary Instruments, Greenville, NC) para obtener secciones. Corte el bloque de agarosa que contiene el VNO para darle forma y péguelo al soporte de tejido (Figura 1E y F). Inserte el soporte de tejido en el cilindro metálico y llene la cámara restante con LMA adicional. Una vez que el LMA se solidifique en hielo, proceda inmediatamente al corte. Introduzca mACSF frío y oxigenado en la cámara de corte y comience a cortar con un grosor de 180-200 μm por sección. Ajuste la velocidad de avance y la frecuencia de vibración para que el tejido no se comprima durante el corte y el VNO no se desprenda del bloque de agarosa. Recoja y transfiera las secciones a una cámara de incubación con mACSF (Figura 2A). Las secciones permanecen viables durante 6-8 horas en mACSF oxigenado a temperatura ambiente. Las Figuras 2B y C muestran imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y de dos fotones de una sección de VNO de G-CaMP2, respectivamente.

3. Configuración de la cámara de imagen

  1. Coloque la sección del órgano vomeronasal (VNO) en el centro de la cámara de perfusión (Siskiyou, Grants Pass, OR) y sujétela con un anclaje para secciones (Warner Instruments, Hamden, CT) (Figura 3A). Los hilos del anclaje deben presionar únicamente contra la parte de la amígdala medial lateral (LMA) de la sección, pero no contra el tejido del VNO. El mACSF oxigenado se suministra a la cámara de perfusión a través del puerto de entrada a aproximadamente 100 μl/seg, y el líquido se drena mediante una aguja de succión a través del puerto de salida, lo que proporciona un flujo continuo de mACSF fresco (Figura 3A y B).
  2. Llene una jeringa de 30 ml con solución de Ringer y sujétela a la bomba de jeringa (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). Ajuste la velocidad de la bomba a 300-600 μl/min para proporcionar un flujo continuo de solución de Ringer sobre la sección (Figura 3C).
  3. Conecte la salida de la solución de Ringer a un bucle de inyección HPLC (Chromtech, Apple Valley, MN) (Figura 3D). Puede seleccionarse un bucle de diferente tamaño para un control preciso del volumen administrado. En nuestros experimentos utilizamos un bucle de 20 μl. El control del bucle de inyección tiene dos rutas de flujo (Figura 3E). En la posición de "carga", las muestras pueden cargarse en el bucle de muestra mediante una jeringa de precisión Hamilton. El exceso de muestra sale del bucle a través de la salida de desecho. La solución de Ringer inyectada por la bomba de jeringa circula alrededor del bucle de muestra y va directamente a la salida, que está conectada a la punta de perfusión (Figura 3A y E). En la posición de "inyección", la solución de la bomba fluye a través del bucle de muestra y empuja los estímulos hacia la salida (Figura 3E). Antes del experimento de adquisición de imágenes, deben eliminarse las burbujas de aire para asegurar un flujo suave del fluido de perfusión. También pueden utilizarse otros sistemas de inyección comerciales o hechos a medida para la administración de estímulos.
  4. Ajuste la punta de perfusión bajo un objetivo de 5X o 10X de modo que la punta quede aproximadamente a 1 mm de distancia de la sección del VNO.
  5. Cuando se monta un nuevo sistema de perfusión, es recomendable medir el tiempo de retardo y la duración de la muestra con un colorante fluorescente. Cargue colorante rodamina 6G al 0,1 % en el bucle de muestra y cambie la válvula a la posición de inyección a los 5 segundos después del inicio de la adquisición de imágenes (Figura 3F). La señal fluorescente se detecta entre los 10 y 30 segundos. La curva suave de la señal fluorescente también indica que no se genera turbulencia significativa bajo el objetivo sumergible y que la perfusión adecuada de mACSF oxigenado llega a la sección.

4. Imagen por lapso de tiempo

  1. Utilizamos el microscopio Zeiss AxioSkope FS2 con un objetivo de inmersión en agua de 10X o 20X para la adquisición de imágenes por lapsos de tiempo. Se utiliza un filtro de paso de banda estándar para GFP (450-490 nm) para las señales de G-CaMP2. Las imágenes epifluorescentes se adquieren mediante una cámara CCD (Zeiss HRM) con binning de 1x1 o 2x2, dependiendo de los niveles de expresión de G-CaMP2.
  2. Configure la velocidad de adquisición en 1 cuadro por segundo. Ajuste la intensidad de la luz para minimizar el apagado de las señales de G-CaMP2 y el daño fotoinducido en las células. Para cada experimento, normalmente adquirimos una pila de imágenes de 60 cuadros (∼60-70 segundos). Cambie la válvula a la posición de inyección en un punto específico de tiempo (por ejemplo, a los 5 segundos en Figura 3F) para un conjunto de experimentos, con el fin de obtener un retraso temporal consistente en todos los ensayos.
  3. Realice una prueba piloto utilizando solución de Ringer como estímulo. Reajuste el sistema de perfusión si se introducen artefactos de movimiento durante la inyección de la muestra.
  4. Realice una prueba de control positivo con orina de ratón diluida 1:100 en solución de Ringer. El valor típico máximo de ΔF/F de la respuesta de G-CaMP2 a la orina de ratón es de aproximadamente 20-40 %. Si es necesario, se puede confirmar la viabilidad del corte aplicando 10 mM de KCl en solución de Ringer para estimular los cortes al final de los experimentos.
  5. Lave la jeringa Hamilton con solución de Ringer al menos tres veces después de cargar un estímulo. Lave el bucle de muestra con solución de Ringer al menos tres veces entre diferentes estímulos. Estos pasos previenen la contaminación cruzada entre diferentes muestras.
  6. Espere de 4 a 10 minutos para que los VSN se recuperen antes de aplicar el siguiente estímulo.

5. Análisis de datos

  1. Realice el registro de imágenes de todas las imágenes adquiridas de una rebanada. Utilizamos un script personalizado escrito en VBA en AxioVision (Carl Zeiss, América del Norte) para automatizar este proceso. Todos los fotogramas de imagen dentro del mismo experimento se registran respecto a un fotograma de referencia común elegido mediante registro elástico (Figura 4A). El registro elástico, también conocido como registro no lineal, es una categoría de técnica de registro de imágenes que enfatiza la transformación no rígida de una imagen objetivo respecto a una imagen de referencia. Aquí utilizamos la implementación disponible en AxioVision.

    Este fotograma de referencia se elige arbitrariamente entre las pilas de imágenes.
  2. Realice la sustracción de imágenes para identificar las células que responden. Utilizamos macros personalizados escritos en ImageJ v1.42 (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) para automatizar este proceso. Se genera una imagen de proyección mínima para cada pila. Las células que responden emergen tras restar la proyección mínima de las pilas originales (Figura 4B).
  3. Identifique la región de interés (ROI) a partir de las pilas sustraídas y obtenga las coordenadas de la ROI utilizando el complemento Multi-Measure de ImageJ. Procese todas las pilas de un experimento y guarde todas las coordenadas de ROI en una lista maestra de ROI (Figura 4C).
  4. Utilice la lista maestra de ROI para medir las respuestas celulares a partir de las pilas de imágenes originales mediante un macro personalizado y el complemento Multi-Measure de ImageJ (Figura 4D). Represente las curvas de respuesta y los mapas de calor en Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA).

6. Resultados Representativos

Un ejemplo del experimento de imagen del órgano vomeronasal (VNO) utilizando muestras de orina recolectadas de cuatro ratones individuales se muestra en la Figura 5. El corte responde a la estimulación con orina con diversos patrones de activación. Se identificaron aproximadamente 80 células que mostraron respuesta a al menos uno de los estímulos urinarios, y sus valores de respuesta ΔF/F se representan en un mapa de calor (Figura 5A). Las trazas de respuesta de las células 1, 2 y 3 se grafican en la Figura 5B, mostrando la activación a lo largo del tiempo inducida por los estímulos urinarios. La célula 1 muestra respuesta a ambas muestras de orina de hembra, pero no a las de macho, mientras que la célula 2 presenta el patrón opuesto de activación y responde únicamente a ambas muestras de macho. La célula 3 es activada por muestras individuales tanto de macho como de hembra. Las células 1 y 2 muestran una respuesta característica a señales específicas del sexo presentes en la orina15.

Disección del órgano vomeronasal (VNO), diagramas anatómicos, configuración de equipos para análisis sensorial.
Figura 1 Ilustración esquemática del proceso de disección del VNO. A. La ubicación anatómica del VNO en la cabeza del ratón. Se ha diseccionado la cabeza de un ratón G-CaMP2 y se ha colocado boca abajo, con los tejidos blandos removidos del paladar para exponer el VNO. La imagen de inserción muestra una imagen fluorescente de la misma muestra. Las neuroepitelios del VNO presentan un color verde brillante. B. Vista lateral del VNO aislado, encerrado dentro del hueso vomer (arriba) y la imagen fluorescente del mismo VNO (abajo). C. Vista coronal del VNO y del proceso de disección. Un VNO se separa del tabique nasal y luego se puede extraer el hueso vomer para liberar el neuroepitelio. D. El VNO se incrusta en LMA. E. El bloque incrustado se pega al porta-tejidos para el corte. El porta-tejidos avanza 180-200 μm por corte, empujando el bloque de agarosa fuera del cilindro metálico para su seccionamiento. La hoja de corte se coloca próxima al cilindro metálico. F. Vista lateral del sistema cortador de tejidos VF300. B.V., vaso sanguíneo. N.E., neuroepitelio.

A. Configuración del microscopio con ajustes ópticos para la adquisición de imágenes; B, C. Imágenes microscópicas de muestras biológicas.
Figura 2 Cortes del OVN. A. Los cortes del OVN se mantienen en mACSF oxigenado a temperatura ambiente. B. Una imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC) del corte del OVN. C. Una imagen de dos fotones del OVN de un ratón G-CaMP2. Escala, 50 μm.

Configuración de perfusión del VNO, bomba de jeringa y diagrama del método de cromatografía con gráfico de resultados.
Figura 3 Ilustración de la configuración del sistema de perfusión. A. Una cámara de perfusión típica con entrada y salida. La sección del VNO se coloca en el centro de la cámara y se presiona con un sujeción de tejido. Los hilos centrales del sujetador se retiran para que el tejido del VNO no quede comprimido. B. La cámara de perfusión se coloca sobre la platina del microscopio bajo el objetivo de inmersión. Se indican la entrada de mACSF, la salida de succión y la punta de perfusión. C. La bomba de jeringa de un solo canal proporciona un flujo continuo de Ringer a través de la punta de perfusión. D. Se utiliza el sistema de bucle de inyección de HPLC para facilitar la carga e inyección de la muestra de estímulo. E. Ilustración esquemática de las direcciones del flujo en las posiciones de carga e inyección. Ringer, verde. Muestra de estímulo, magenta. Las flechas indican la dirección del flujo. F. Medición del retardo y tiempo de lavado del sistema de perfusión. Se carga el colorante fluorescente Rodamina 6G en el bucle de muestra y la válvula se cambia a la posición de inyección en el segundo 5, lo cual se indica con una flecha. El cambio en la señal fluorescente se detecta entre los 10 y 30 segundos y disminuye posteriormente.

Registro de imágenes y procesamiento de ROI en microscopía con análisis de respuesta a estimulación y descripción general del conjunto de datos.
Figura 4 Secuencia de procesamiento de imágenes. A. Todos los fotogramas de imagen para un corte se registran respecto a un fotograma de referencia. B. Sustracción de la proyección mínima de una pila de imágenes de sus fotogramas originales. Las células que responden se hacen más evidentes tras la sustracción. C. Se seleccionan las regiones de interés (ROI) y sus coordenadas se agrupan en una lista maestra. D. Medición de las células que responden utilizando la lista maestra de ROI aplicada a la pila de imágenes original.

Mapa de calor y gráficos de líneas que muestran el análisis de ΔF/F; comparación de datos de FVB, CBA y BL6 sobre actividad neuronal.
Figura 5 Un experimento representativo de imagenología del órgano vomeronasal (VNO) con G-CaMP2. A. El mapa de calor de la respuesta ΔF/F de un corte estimulado con orina individual de machos y hembras. Las muestras de orina se recogen de ratones individuales machos y hembras. Eje X, células respondientes identificadas en el corte. Eje Y, muestras de orina utilizadas en el experimento. La barra de colores indica el valor de ΔF/F. B. Curso temporal de la respuesta de 3 células representativas marcadas en A. Las flechas indican el momento de la aplicación del estímulo. F-FVB, hembra FVB; F-CBA, hembra CBA; M-FVB, macho FVB; M-BL6, macho C57BL/6.

Tabla de reactivos y equipos específicos:

Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
cámara de perfusiónSiskiyouPC-Hhorizontal
sujeción para cortesWarner InstrumentsSHD-22CL 
soporte para puerto de perfusiónALA scientific, Inc.MPIOH-S 
bomba de jeringaNew Era Pump Systems, Inc.NE-300 
válvula de inyección de baja presiónChromtechV-451 
tubo de PEEKChromtech15311/16" OD, 0.25mm ID
lazo de muestra de PEEKChromtech180320 μL
jeringa HamiltonChromtech80630100 μL

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Discusión

La mayoría de los receptores vomeronasales (VR) permanecen como receptores huérfanos desde su descubrimiento por Dulac y Axel 5. Los ligandos feromonales para estos receptores quimiosensoriales y sus funciones en la mediación de comportamientos animales no están bien comprendidos. Hasta ahora, solo se ha identificado un par ligando/receptor, el péptido ESP1 y su receptor homólogo Vmn2r116 (V2Rp5), que ha demostrado transmitir información social específica 19,23. Se ha demostrado que otro receptor, V...

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Divulgaciones

No se declararon conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Andrea Moran junto con los miembros del Servicio de Instalaciones para Animales de Laboratorio (LASF) del Instituto Stowers por su excelente apoyo en manejo animal y servicios técnicos. Este trabajo cuenta con financiamiento del Instituto Stowers y los NIH (NIDCD 008003) otorgado a CRY. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre la Sordera y otros Trastornos de la Comunicación ni de los Institutos Nacionales de Salud. Patente estadounidense en trámite para los ratones tetO-G-CaMP2 a nombre del Instituto Stowers, CRY y LM.

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Referencias

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