El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados
En este artículo
Resumen
Resumen
El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales quimiosensoriales que portan información sobre el estado social, sexual y reproductivo de los individuos de la misma especie 1,2. Estas señales intraspecíficas, las feromonas, así como señales de algunos depredadores 3, activan a las neuronas sensoriales vomeronasales (VSNs) con altos niveles de especificidad y sensibilidad 4. Al menos tres familias distintas de receptores acoplados a proteínas G, V1R, V2R y FPR 5-14, se expresan en las neuronas del VNO para mediar la detección de las señales quimiosensoriales. Para comprender cómo se codifica la información feromonal por el VNO, es fundamental analizar los perfiles de respuesta de neuronas VSN individuales frente a diversos estímulos e identificar los receptores específicos que median estas respuestas.
Las neuroepitelios del órgano vomeronasal (VNO) están encerrados en un par de huesos vomerinos. La estructura tubular semicerrada del VNO tiene un extremo abierto (el conducto vomeronasal) que se conecta con la cavidad nasal. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) extienden sus dendritas hacia la parte luminal del VNO, donde las señales de feromonas entran en contacto con los receptores expresados en los botones dendríticos. Los cuerpos celulares de las VSN forman capas pseudoestratificadas, con V1R y V2R expresados en las capas apical y basal, respectivamente 6-8. Se han utilizado varias técnicas para monitorear las respuestas de las VSN a estímulos sensoriales 4,12,15-19. Entre estas técnicas, la preparación de cortes agudos ofrece varias ventajas. Primero, en comparación con las VSN disociadas 3,17, las preparaciones en corte mantienen a las neuronas en su morfología nativa y las dendritas de las células permanecen relativamente intactas. Segundo, los cuerpos celulares de las VSN son fácilmente accesibles en cortes coronales del VNO, lo que permite estudios de electrofisiología y experimentos de imagen, a diferencia de las preparaciones de epitelio completo y montajes completos 12,20. Tercero, este método puede combinarse con técnicas de clonación molecular para permitir la identificación de receptores.
La estimulación sensorial provoca una fuerte entrada de Ca2+ en las VSN, lo que indica la activación del receptor 4,21. Por lo tanto, desarrollamos ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en las neuronas sensoriales olfativas, incluidas las VSN 15,22. La sensibilidad y la naturaleza genética de la sonda facilitan enormemente los experimentos de imagen de Ca2+. Este método ha eliminado el proceso de carga con colorante utilizado en estudios previos 4,21. También empleamos un sistema de administración de ligandos que permite aplicar diversos estímulos a cortes del órgano vomeronasal. La combinación de ambas técnicas nos permite monitorear simultáneamente múltiples neuronas en respuesta a un gran número de estímulos. Finalmente, hemos establecido una canalización de análisis semiautomatizada para ayudar en el procesamiento de imágenes.
Protocolo
1. Preparación de la solución
- Prepare soluciones 10X R1, 10X R2 y 10X R3 según la tabla.
R1
<....Productos químicos MW(g/mol) mM (1X) 10X stock (g/L) NaCl 58.44 125 73.05 KCl 74.55 2.5 1.86 MgCl2 1 M stock 1 10 ml CaCl2·2H2O 147.02 2 2.94
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La mayoría de los receptores vomeronasales (VR) permanecen como receptores huérfanos desde su descubrimiento por Dulac y Axel 5. Los ligandos feromonales para estos receptores quimiosensoriales y sus funciones en la mediación de comportamientos animales no están bien comprendidos. Hasta ahora, solo se ha identificado un par ligando/receptor, el péptido ESP1 y su receptor homólogo Vmn2r116 (V2Rp5), que ha demostrado transmitir información social específica 19,23. Se ha demostrado que otro receptor, V.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Andrea Moran junto con los miembros del Servicio de Instalaciones para Animales de Laboratorio (LASF) del Instituto Stowers por su excelente apoyo en manejo animal y servicios técnicos. Este trabajo cuenta con financiamiento del Instituto Stowers y los NIH (NIDCD 008003) otorgado a CRY. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre la Sordera y otros Trastornos de la Comunicación ni de los Institutos Nacionales de Salud. Patente estadounidense en trámite para los ratones tetO-G-CaMP2 a nombre del Instituto Stowers, CRY y LM.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Referencias
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
