La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Resumen

Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.

Resumen

Quinasa de acetato, un miembro del acetato y el azúcar-quinasa Hsp70-actina (ASKHA) superfamilia de enzimas ^1-5, es el responsable de la fosforilación reversible de acetato de acetil fosfato que utilizan ATP como sustrato. Acetato de quinasas son muy abundantes en las bacterias, que se encuentra en un género de Archaea, y también están presentes en los microbios de la Eukarya ^6. El acetato quinasa mejor caracterizados es que a partir del metano que producen thermophila archaeon Methanosarcina ^14.07. Una quinasa acetato de que sólo se puede utilizar PP _i ATP, pero no en la dirección de la acetil-fosfato forman se ha aislado de Entamoeba histolytica, el agente causante de la disentería amebiana, y hasta el momento sólo se han encontrado en este género ^15,16.

En la dirección de la formación de acetil fosfato, acetato de actividad quinasa se mide típicamente usando el ensayo de hidroxamato, describió por primera vez por Lipmann^17-20, un ensayo acoplado en lo que se suma la conversión de ATP a ADP a la oxidación de NADH a NAD ⁺ por la piruvato quinasa enzimas lactato deshidrogenasa y ^21,22, o un ensayo de medición de la liberación de fosfato inorgánico después de la reacción del producto acetil fosfato con hidroxilamina ^23. Actividad en la dirección opuesta, el acetato de formación de la dirección se mide mediante el acoplamiento de la formación de ATP a partir de ADP a la reducción de NADP ⁺ a NADPH por las enzimas hexoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa ^24.

Aquí se describe un método para la detección de la actividad quinasa de acetato en la dirección de la formación de acetato que no requiere de enzimas de acoplamiento, sino que se basa en la determinación directa del consumo de acetil fosfato. Después de la reacción enzimática, fosfato restante acetil se convierte en un complejo hidroxamato férrico que se puede medir espectrofotométricamente, como para el ensayo de hidroxamato. Por lo tanto, a diferencia del stensayo andard junto a esta dirección, que depende de la producción de ATP a partir de ADP, este ensayo directo se pueden utilizar para las quinasas de acetato que producen ATP o PP _i.

Protocolo

El esquema general de este protocolo se describe en la figura 1.

1. Preparación para la solución de las curvas de calibración y ensayos

1. Preparar 100 ml de una 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de clorhidrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) y se disuelven en aproximadamente 50 ml de agua destilada, agua desionizada (DDC ₂ O). Ajustar el pH a 7.0 con pellets de hidróxido de potasio o una solución concentrada. Llevar el volumen final de 100 ml. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 30 días o menos 4 ° C durante un máximo de 90 días.
2. Preparar 100 ml de cloruro férrico una / solución de ácido clorhídrico. Pesar 13,5 g de cloruro férrico (MW 270,32 g / mol) y se disuelven en aproximadamente 50 ml ddH ₂ O. Añadir 41,3 ml de ácido clorhídrico concentrado (12,1 mol / L) y llevar a un volumen final de 100 ml. La concentración final de cloruro férrico será de 0,5 mol / L y la concentración final de ácido clorhídrico será de 5 mol/ L. La solución se almacena a temperatura ambiente.
3. Preparar 100 ml de una 1.84 mol / L de ácido trichoroacetic. Pesar 30,0 g de ácido tricloroacético (MW 163,39 g / mol), se disuelven en _ddH2O y llevar el volumen final de 100 ml. La solución se almacena a temperatura ambiente.
4. Preparar 5 ml de un 0,1 mol / L solución de fosfato de acetilo. Pesar 0,092 g de fosfato de acetilo (MW 184,06 g / mol), se disuelven en _ddH2O y llevar el volumen final de 5 ml. Alícuota de la solución a tubos de microcentrífuga (0,25 ml por tubo) y congelar a -20 ° C hasta su uso. Solución descongelada debe ser colocado en hielo y se puede utilizar durante aproximadamente 1 hora. Solución de fosfato de acetil que ha sido descongelado no debe volver a congelarse y reutilizarse.
5. Preparar 5 ml de un 0,1 mol / L de ADP. Pesar 0,24 g de ADP (MW 472,5 g / mol), se disuelven en _ddH2O, y llevar el volumen final de 5 ml. Alícuota de la solución en tubos de microcentrífuga (0,5 ml por tubo) y congelar a -20 ° C hastauso. Mantener la solución descongelada en el hielo hasta su uso.
6. Prepare 50 ml de una 1 mol / L de Tris. Pesar 6,06 g de Tris (MW 121,14 g / mol), y se disuelven en 40 ml ddH ₂ O. Ajustar el pH de la solución a 7,0 con ácido clorhídrico y alcanzar un volumen final de 50 ml. Guarde la solución a temperatura ambiente.
7. Prepare 10 ml de un 1 mol / L de solución de cloruro de magnesio. Pesar 2,03 g de cloruro de magnesio (MW 203,31 g / mol), se disuelven en _ddH2O, y alcanzar un volumen final de 10 ml. Guarde la solución a temperatura ambiente.
8. Prepare 25 ml de solución de desarrollo mediante la mezcla de volúmenes iguales de la solución de ácido de cloruro férrico / clorhídrico y la solución de ácido tricloroacético. Solución de desarrollo deben estar preparados frescos cada día y se almacena a temperatura ambiente.

2. Preparación de una curva estándar de fosfato acetil

1. Una curva estándar de fosfato de acetilo se genera utilizando cantidades conocidas de acetil fosfato. Una curva estándar de seis a eighpuntos t es adecuado. Las normas deben variar entre 0,03 a 0,9 moles moles por cada 300 l, que se correlaciona con la concentración final de 0,1 a 3 mmol / L. Diluir la solución de fosfato de valores acetilo a las concentraciones adecuadas de solución de Tris 100 mM en un volumen final de 300 mL. Una muestra de control sin acetil fosfato también deben estar preparados.
2. Incubar cada estándar y el control de los 37 ° C en un bloque de calor durante 1 minuto.
3. Añadir 50 l de la solución de clorhidrato de hidroxilamina a cada norma y el control y la mezcla agitando tres veces. Coloque el estándar en un bloque de 60 ° C de calor y se incuba durante cinco minutos.
4. Añadir 100 ml de solución de desarrollo de las normas y el control, la mezcla agitando tres veces, y permitir que se desarrolle el color de al menos un minuto a temperatura ambiente.
5. Centrífuga con todas las normas y el control en una microcentrífuga a 18.000 xg durante 1 minuto.
6. Mediciones de las muestras por espectrofotometría unt 540 nm con cubetas de plástico de 1 ml, utilizando el control como el espacio en blanco para espectrofotometría.
7. Generar una curva estándar utilizando el análisis de datos y el software adecuados de gráficos (por ejemplo, KaleidaGraph, Synergy Software). Valores de R ² de 0.99 o superior son deseables. Los datos se representan como la absorbancia a 540 nm frente a moles de fosfato presente acetilo.

3. Ensayo para la actividad quinasa de acetato

1. Utilizando las soluciones descritas, prepare una mezcla de reacción que contiene una concentración final de 0,1 buffer mol / L Tris, 10 mmol / L de cloruro de magnesio, 5 mmol / L de ADP, y 2 mmol / L acetil fosfato. Una mezcla de 10 ml de reacción se requieren 8,2 ml _ddH2O, 1,0 ml de solución de Tris, 0,1 ml de solución de cloruro de magnesio, 0,5 ml de solución de ADP, y 0,2 ml de solución de fosfato de acetilo. Distribuir la mezcla de reacción de 300 alícuotas a tubos de microcentrífuga. Para la determinación de parámetros cinéticos y la optimización de las concentraciones de sustrato, un sustrato puede servariado y la otra sostenía a una concentración constante en las reacciones.
2. Pre-incubar la reacción durante 1 minuto a 37 ° C en un bloque de calor.
3. Agregar la cantidad deseada de enzima a la reacción y devolvió el tubo en el bloque de 37 º C de calor. También incluyen una reacción de control para que no se añade la enzima. Si las reacciones se realizan varias, añadir la enzima a los tubos a intervalos de tiempo específicos. Asegúrese de mantener la noción del tiempo. (NOTA: La cantidad de enzima que se utilizará tendrá que ser optimizado para asegurar que todos los de la acetil fosfato o sustrato ADP no se agotará - véase la sección de discusión)
4. Después de 5 minutos, agregar 50μl de la solución de clorhidrato de hidroxilamina a cada reacción y el control, mezclar y colocar los tubos en un bloque de 60 ° C de calor. Si varias reacciones se llevan a cabo, esto debe hacerse en el mismo intervalo de tiempo que la enzima se añadió.
5. Incubar las reacciones y controlar el durante 5 minutos a 60 ° C.
6. Añadir 100 ymu; L de la solución de desarrollo de cada reacción y el control, mezclar y colocar en un soporte de tubos en el banco de laboratorio. De formación de color por lo menos durante 1 minuto.
7. Centrifugar todos los tubos en una microcentrífuga a 18.000 xg durante 1 minuto.
8. Mediciones de muestras con un espectrofotómetro a 540 nm con cubetas de plástico de 1 ml y determinar la cantidad de fosfato presente acetil en comparación con la curva estándar de fosfato de acetilo.
9. La cantidad de sustrato acetil fosfato reducido se puede determinar restando la cantidad de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática de la cantidad de acetil fosfato presente en la enzima de control insuficiente. Realizar análisis de datos a partir de datos de gráficos y el software adecuados (por ejemplo, KaleidaGraph, Synergy Software). R ² valores superiores a 0,97 son deseables.

4. Los resultados representativos:

El propósito de este ensayo es medir la actividad de acetato quinasa en la directaión de la formación de acetato. Esto se hace mediante la medición de consumo de sustrato acetil fosfato, ya que no existe una medición sencilla y directa para la producción de acetato. Acetil fosfato que queda después de un momento dado durante la reacción enzimática se convierte en hidroxamato acetil y, posteriormente, al complejo hidroxamato férrico, que tiene un color rojizo (Figura 2) que se puede medir a 540 nm. La curva estándar de absorbancia frente trazado actual moles acetil fosfato en las normas se utiliza para determinar la cantidad de acetil fosfato restante en cada reacción. La curva estándar debe ser lineal a través del punto cero. Una curva estándar representativo se muestra en la Figura 3 tiene una pendiente de 1,2332 unidades de absorbancia por presentar mol acetil fosfato y un valor de R ² de 0,99, indicando que los datos se ajusta a la ecuación lineal también. La ecuación para el ajuste lineal a los datos de la curva estándar se utiliza para el cálculo de la cantidad de acetil fosfato restante en la reacción. Los molesde acetil fosfato consumido se determina como la diferencia entre los moles de acetil fosfato presente en la reacción de control que carecen de la enzima y la moles de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática.

Purificada, recombinante M. quinasa thermophila acetato fue ensayada mediante el protocolo descrito. Para el experimento se muestra en la Figura 4, la concentración de ADP se mantuvo constante en 5 mmol / L y la concentración de acetil fosfato en la reacción fue variada para determinar el _m K de acetil fosfato. Como era de esperar, este experimento demuestra que la enzima siguiente estándar de Michaelis-Menten, como la cinética de cada sustrato y produce una curva de saturación hiperbólica al trazar la actividad frente a la concentración de fosfato de acetilo. La aparente K _m valor de acetil fosfato fue de 0,27 ± 0,01 mmol / L, que se compara favorablemente con el valor publicado K _m de 0,47 ± 0,01 mmol / L, junto con el dedecir ^13.

El ensayo directo también se puede utilizar para medir la actividad de las quinasas de acetato que utilizan otros sustratos de la ATP, que no es posible con la prueba estándar acoplados. Recombinante E. histolytica acetato quinasa ^16, que produce PP _i en lugar de ATP en la dirección de acetato de formación, fue sometido a esta prueba con fosfato de sodio en lugar de ADP. La concentración de fosfato de sodio en la reacción se mantuvo constante a 0,2 mol / L y la concentración de acetil fosfato era variada. En cuanto a la M. thermophila quinasa acetato, la E. quinasa histolytica acetato seguido de Michaelis-Menten, como la cinética de acetil fosfato y una curva de saturación hiperbólica se observó (Figura 5). La aparente K _m valor de acetil fosfato fue de 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves y Guthrie ¹⁵ determina un valor de K _m de 0,06 mmol / L de acetil fosfato de la enzima nativa, cómo embargo, la enzima fue parcialmente purificada y su ensayo involucró a cuatro enzimas de acoplamiento que también fueron sólo parcialmente purificada. Por lo tanto, es difícil comparar directamente estos valores.

Protocolo de Régimen

1. Generar una curva estándar de fosfato de acetilo
2. Diluir la enzima a la concentración deseada
3. Prepare la mezcla de reacción y la alícuota de 300 l con tubos de microcentrífuga
4. Reacciones preincubar a 37 ° C durante 1 minuto
5. Inicio reacciones mediante la adición de enzimas a intervalos de tiempo específicos
6. Añadir hidroxilamina en los mismos intervalos de detener las reacciones y se incuba a 60 ° C durante 5 minutos
7. Añadir cloruro férrico / solución de ácido tricloroacético para el desarrollo de color
8. Centrifugar los tubos a 18.000 xg durante 1 minuto
9. Medir la absorbancia a 540 nm
10. Determinar la cantidad de acetil fosfato consumido en comparación con la curva estándar

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Figura 1. Esquema de Protocolo

Figura 2. Normas acetil fosfato. Aumento de las concentraciones de fosfato de acetilo reacciona con hidroxilamina y el color se desarrolló tal como se describe. El control que carecen de acetil fosfato es de color amarillo brillante, y las reacciones que contienen cantidades crecientes de acetil fosfato son sucesivamente de color más oscuro. Este cambio de color se mide a 540 nm.

Figura 3. Ejemplo de curva estándar acetil fosfato. Cantidades variables de acetil fosfato se hicieron reaccionar con hidroxilamina y el desarrollo de soluciones de color y se midió la absorbancia a 540 nm. La absorbancia a 540 nm frente a fosfato de moles acetil fue trazada y un ajuste lineal de los datos se aplicó.

Figura 4. Utilización de acetil fosfato por el M. ATP que producen thermophila quinasa acetato. La actividad enzimática se determinó en la dirección de la formación de acetato en presencia de 5 mmol / L de ADP con diferentes concentraciones de acetil fosfato. La cantidad consumida de acetil fosfato se determinó como la diferencia entre el importe de partida de acetil fosfato en la reacción y la cantidad de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática. Los ensayos se realizaron por triplicado con barras de error se muestra.

Figura 5. Utilización de acetil fosfato por el PP _{i-producción} de E. histolytica quinasa acetato. La actividad enzimática en la dirección de la formación de acetato se determinó en presencia de 0.2 mol / L de fosfato de sodio con diferentes concentraciones de acetil fosfato. La cantidad consumida de acetil fosfato se determinó como la diferencia entre el importe de partida de acetil fosfato en la reacción y la cantidad de acetil fosfato que queda después de la reacción enzimática. Los ensayos se realizaron por triplicado con barras de error se muestra.

Discusión

La detección de acetil fosfato en este ensayo depende de una suficiente concentración de clorhidrato de hidroxilamina y la concentración y la acidez de la solución de cloruro férrico. Alteración del volumen de ensayo requiere la reconsideración de estos dos componentes. Las reacciones enzimáticas que se describe aquí se realizaron a 37 ° C con la terminación hidroxilamina realiza a 60 ° C durante 5 minutos. Esta temperatura más alta es fundamental para permitir la rápida transformación de la acetil fosfato restante a hi...

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetil fosfato	Sigma Aldrich	01409	La sal de litio (97%)
Fosfato de sodio monobásico (deshidratación)	ThermoFisher	S381
Fosfato de sodio dibásico (anhidro)	ThermoFisher	S374
Cloruro de magnesio (hexahidratado)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Cloruro férrico (hexahidratado)	ThermoFisher	I88
El ácido tricloroacético	ThermoFisher	A324
Hidroxilamina hidrocloruro	ThermoFisher	H330
5'-difosfato de adenosina sal de sodio	Sigma Aldrich	A2754
BIOMATE III Espectrofotómetro	ThermoFisher	142982082	Estándar de UV / Vis espectrofotómetro