Una rápida En vivo Ensayo para probar compuestos de neuromoduladores que utilizan el sistema de fibra gigante (GFS) de los Drosophila melanogaster Se describe. Nanoinjections en la cabeza del animal, junto con registros electrofisiológicos de la EFP puede revelar la bioactividad de compuestos en las neuronas o músculos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante
En este artículo
Resumen
Resumen
Compuestos de cribado para la actividad in vivo puede ser utilizado como un primer paso para identificar a los candidatos que pueden ser desarrollados en 1,2 agentes farmacológicos. Hemos desarrollado un novedoso nanoinjection / electrofisiología ensayo que permite la detección de efectos moduladores bioactivos de los compuestos sobre la función de un circuito neuronal que media la respuesta de escape en la Drosophila melanogaster 3,4. Nuestro ensayo in vivo, que utiliza el sistema Drosophila gigante de fibra (EFP, Figura 1) permite la detección de diferentes tipos de compuestos, tales como pequeñas moléculas o péptidos, y requiere sólo cantidades mínimas para provocar un efecto. Además, el GFS Drosophila ofrece una gran variedad de posibles dianas moleculares en las neuronas o músculos. Las fibras gigantes (GFS) sinapsis eléctrica (uniones Gap), así como químicamente (colinérgico) en una sinapsis periférica Interneuron (PSI) y la neurona Tergo trocantéreo muscular (TTMn) 5 6. Por último, las uniones neuromusculares (UNM) de la TTMn y la DLMn con el salto (TTM) y los músculos de vuelo (DLM) son glutamatérgica 7-12. Aquí, demostramos cómo inyectar cantidades nanolitros de un compuesto, mientras que la obtención de registros intracelulares electrofisiológicos del sistema de fibra gigante 13 y cómo controlar los efectos del compuesto sobre la función de este circuito. Se muestra la especificidad de la prueba con citrato de methyllycaconitine (MLA), un antagonista de nAChR, que interrumpe a la ISP a DLMn conexión, pero no el GF TTMn conexión o la función de la UNM en el salto o los músculos del vuelo.
Antes de comenzar este video es muy importante que se observe con atención y se familiaricen con el video titulado "Jove registros electrofisiológicos de la vía fibra gigante de D. melanogaster "de Augustin et al 7, como el video que aquí se presenta pretende ser una expansión de esta técnica existente. Aquí se utiliza el método de los registros electrofisiológicos y el enfoque en detalle sólo en la suma de los pares de nanoinjections y la técnica de monitoreo.
Protocolo
1. Electrofisiología Rig Set-up
- El equipo requerido para el equipo de perforación electrofisiología configuración se describe en detalle por Augustin et al. en este Diario 14. Por favor, consulte este artículo para obtener una explicación detallada de los aparatos electrofisiológicos necesarios.
- Modificar el equipo de electrofisiología se ha descrito anteriormente puesta a punto 14 mediante la adición de un micromanipulador sexto, que ocupa la nanoinjector. Para facilitar el acceso a la cabeza del animal que debe ser colocado entre los dos electrodos estimulantes micromanipuladores como se muestra en la Figu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El bioensayo nanoinjection / electrofisiología que aquí se presenta permite una detección rápida de los compuestos en el sistema nervioso de la mosca de la fruta. Esta es una novedosa técnica in vivo que requiere pequeñas cantidades de un compuesto para provocar un efecto sobre una variedad de objetivos moleculares en un circuito bien caracterizado neuronal. Este método puede ser utilizado para probar la bioactividad de compuestos diferentes, de las toxinas desconocidas a agentes farmacológicos disponi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio y el laboratorio de Mari Godenschwege, en particular, Yonezawa Aline, por los comentarios y ayuda con este protocolo. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de subvención R21NS06637 de FM y TAG, AB fue financiado por el número de la National Science premio de la Fundación 082925, MUR: Biología Integrativa para futuros investigadores.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Electrodos de registro de vidrio: vidrio borosilicato capilares | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Estimulador | Grass Instruments | Modelo S48 | |
| Amplificador | Obtener Instruments Inc. | Modelo 5A | |
| Adquisición de datos del software: Digidata | Molecular Devices | Modelo 1440A | |
| Los datos del software colección: pCLAMP | Molecular Devices | La versión 10 | |
| Estereomicroscopio wde fibra óptica ésima microscopio de lámpara anular | AmScope | SM-4T Modelo HL250-AR | |
| La disección de alcance para el montaje | AmScope | SM-2TZ | |
| Manual de Kite Micromanipulador y basculante Base | World Precision Instruments | Modelo # M3301 Kite: Modelo # KITE-M3-L | |
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotipo (cepa de tipo salvaje) | Bloomington Stock Center | Foto # 3892 | |
| Extractor vertical la pipeta | David Kopf Instruments | Modelo 700C | |
| Micropipetas de inyección de vidrio: vidrio borosilicato capilares | World Precision Instruments | Catálogo # 4878 | 1.14mm diámetro exterior, 0,5 mm ID |
| Aceite de silicona | Pescador | Catálogo # S159-500 | |
| Biselador | Sutter Instrument Co. | KT Brown Tipo Modelo # BV-10 | |
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catálogo # B203XVY | |
| Colorante azul | McCormick | N / A | Ingredientes: agua, propilenglicol, FD & C Azul 1, y el 0,1% Propilparabeno (conservante). |
| Methyllycaconitine citrato (MLA) | Bioscience Tocris | Catálogo # 1029 | |
| Barras de plástico de cera | Hygenic Corporation (Akron, Ohio, EE.UU.) |
Referencias
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
Sistema de fibras gigantes de DrosophilaEnsayo de electrofisiología por nanoinyecciónCribado de bioactividad de compuestosRegistros electrofisiológicosInyector Nanoliter 2000Vía de las fibras gigantesAnálisis de la unión neuromuscularReceptores nicotínicos de acetilcolinaEstimulación de neuronas motorasCircuito de respuesta de escape
