Summary
Beskriver vi en fremgangsmåde protokol for GC-analyse af aldonitrile acetat derivater af glucosamin og muramic syre ekstraheret fra jord. Til belysning af den kemiske mekanisme også præsenteres en strategi for at bekræfte strukturen af derivatet og ion-fragmenterne dannet ved elektron ionisering.
Abstract
Kvantitative metoder til at karakterisere mikroorganismer er afgørende for en bredere forståelse af den mikrobielle status og funktion i økosystemerne. Aktuelle strategier for mikrobiel analyse omfatter både traditionelle laboratorie kultur-afhængige teknikker og de er baseret på direkte udvinding og bestemmelse af visse biomarkører 1, 2. Få blandt mangfoldigheden af mikrobielle arter bebo jorden kan dyrkes, så kultur-afhængige metoder medføre store afvigelser, en begrænsning fraværende i biomarkør analyse.
Den glucosamin, mannosamin, galactosamin og muramic syre er blevet godt tjent som foranstaltninger af både levende og døde mikrobiel masse af disse glucosamin (hyppigst forekommende) og muramic syre (unik fra bakteriecellen) er de vigtigste bestanddele i jorden systemerne 3 , 4. Men manglende viden om analysen begrænser den brede popularization mellem videnskabelige jævnaldrende. Blandt alle existikke analysemetoder, derivatisering til aldononitrile acetater efterfulgt af GC-analyse har vist sig som en god mulighed for med hensyn til optimalt afbalancere præcision, følsomhed, enkelhed, god kromatografisk separation, og stabilitet ved prøveopbevaringsperioden 5.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for en pålidelig og relativt enkel analyse af glucosamin og muramic syre fra jorden efter deres konvertering til aldononitrile acetater. Protokollen hovedsageligt består af fire trin: syre fordøjelse, prøve rensning, derivatisering og GC beslutsomhed. Den trin-for-trin procedure er modificeret i henhold til tidligere publikationer 6, 7. Desuden præsenterer vi en strategi for strukturelt validere molekylære ion af derivatet og dets ion-fragmenter dannet ved elektron ionisering. Vi anvendte GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS og isotopisk mærkede reagenser til bestemmelse af molekylvægten af aldononitrile acetat derivatiseret glucosamin og muramidsyre, anvendte vi massen forskydning af isotop-mærkede derivater af ion-spektret til at undersøge ion fragmenter af hver derivater 8. Ud over den teoretiske belysningen vil validering af molekylære ion af derivatet og ion-fragmenter være nyttigt at forskere ved hjælp δ 13C eller ion fragmenter af disse biomarkører i biogeokemiske undersøgelser 9, 10.
Protocol
1. Prøveforberedelse og syreekstraktion
- Frysetørre jordprøver efter feltet kollektion.
- Male og homogeniseres jordprøver anvendelse af en kuglemølle, jord kværn eller en morter og pistil.
- Afvej jordprøver (indeholdende> 0,3 mg N) i en 25 ml hydrolyse kolbe.
- Tilsæt 10 ml 6M HCI i hver hydrolyse kolbe fyldes N2-gas i kolberne, og låg.
- Hydrolysere ved 105 ° C i en inkubator i 8 timer under anvendelse af en auto kontaktur.
2. Sample Oprensning
- Fjerne kolberne fra inkubatoren, afkøles til stuetemperatur.
- Tilsæt 100 pi intern standard myo-inositol (1 mg ml-1 i vand) til hver kolbe, blandes ved omhvirvling.
- Opsætning plast tragte afløb i 200 ml pæreformede kolber med ST / NS 24/40 samlinger, der på plastikkrus for stabilitet.
- Fold Whatman # 2 Kvalitative Circles (11 cm i diameter) i kvarte og sæt til skorstene. Swirl hver hydrolyse kolbe, og hælde gylle i tragt til at filtrere (du kan endvidere skylles hver kolbe med ~ 3 ml vand).
- Tør filtratet under anvendelse af en rotationsinddamper ved ~ 45 ° C, påføring af vakuum.
- Resuspendere den tørrede remanens fra hver pære kolbe med 3 ~ 5 ml vand (anvende ultralydbad om ønsket) og hældes i en 40 ml Teflon-rør, Kolben skylles med en anden portion vand.
- PH indstilles til 6,6-6,8 med 1 M KOH-opløsning til udfældning af metalioner og andre organiske molekyler.
- Fjerne bundfald ved centrifugering ved 2000 RCF i 10 minutter.
- Hæld supernatanten til et 40 ml glasrør, omfatter røret åbningen med parafilm, fryse ved -20 ° C, derefter stikke hul i parafilm.
- Frysetørre det frosne supernatanten for at fjerne al væske.
- Remanensen opløses med 3 ml tør methanol, vortexbehandling grundigt (anvende ultrasoniske bad om ønsket), hætten røret og centrifugeres ved 2000 RCF i 10 minutter for at løseud salte.
- Supernatanten overføres til en 3 ml konisk reaktionshætteglas, inddampes til tørhed ved RapidVap maskinen ved 45 ° C (eller under en svag strøm af tør nitrogen gas, hvis det ønskes).
- Til hvert hætteglas, 100 uL genvinding standard N-methylglucamin (1 mg ml-1 i vand) og 1 ml H2O tilsættes, omfatter hætteglas mundinger med parafilm og fryser ved -20 ° C, perforere parafilm og derefter frysetørre .
- Gøre standarder: 100 pi muramic syre (0,5 mg ml-1 i methanol), 100 gl glucosamin (1 mg ml-1 i vand), 100 gl myo-inositol (1 mg ml-1 i vand), 100 ul N- methylglucamin (1 mg ml-1 i vand), og 1 ml H2O, parafilm hvert hætteglas, fryse ved -20 ° C, perforere parafilm og derefter frysetørre.
3. Derivatisering
- Forberede derivatiseringsreagens indeholdende 32 mg ml-1 hydroxylamin-hydrochlorid og 40 mg ml-1-4-dimethylamino-pyridine i pyridin-methanol (4:1 v / v).
- Tilsæt 300 pi af derivatiseringsreagens til hver af de reactivials, låg og vortex grundigt.
- Sættes hætteglassene i 75-80 ° C vandbad i 35 minutter (og forseglet hætteglas at undgå, at noget vand at komme ind i hætteglas).
- Tag hætteglas fra vandbadet, og afkøles til stuetemperatur.
- Tilsæt 1 ml eddikesyreanhydrid til hver af 3 ml reactivials, låg og vortex grundigt og derefter genopvarmning i 75-80 ° C vandbad i 25 minutter.
- Tag hætteglas fra vandbadet, og afkøles til stuetemperatur.
4. Separation og måleudstyr
- Tilsæt 1,5 ml dichlormethan til hvert hætteglas, cap stramt, og vortex grundigt.
- Tilsæt 1 ml 1 M HCl til hvert hætteglas, låg og vortex grundigt at tillade løse stå, indtil de to sætninger separate, aspireres og kassere den øverste (vandige) fase under anvendelse 1000 uL pipette.
- I samme fashion, ekstraher det organiske fase 3 gange, men med 1 ml H2O (med det sidste vasketrin, særlig omhu tage for at sikre, at al den vandige øverste fase er blevet fjernet).
- Tør den endelige opløsning med RapidVap ved 45 ° C (eller tør anvendelse af nitrogengas, hvis det ønskes).
- Opløses i 300 pi ethylacetat-hexan (1:1 v / v) og overføres til 2 ml ravfarvet skruelåg hætteglas med et lille volumen insert og låg.
- Til kvantificering, analysere ved GC-FID med en sintret silica polær kapillarsøjle: 30 m lang, 0,25 mm ID, 0,25 um filmtykkelse; stationær fase 5% phenyl-, 95% methyl-polysiloxan (DB-5 eller tilsvarende) med hydrogen eller helium som bæregas. 0,5 ml/min.-1 konstant flow Den kromatografi er bedre på premium "inert" faser og brint bæregas, men er acceptabel på de mere almindelige sorter og med helium. Detektoren indstillinger er 300 ° C, 400 ml min-1 luft og 30 ml min-1 for både nitrogen ogbrint makeup gasser. Injektion og ovn parametre er som følger: 1 pi splitinjektion (30:1) med GC indløbet indstillet på 250 ° C; indledende ovntemperaturen, 120 ° C, hold 1 min; forøge ovnens temperatur på 10 ° C min. -1 til 250 ° C, hold 2,5 min. rampe til 270 ° C ved 20 ° C min-1; holde 2 minutter; rampe til 290 ° C ved 20 ° C min-1, holder 5 min. Justere bæregas strømningshastighed, således at inositol, glucosamin og muramic syrederivater eluerer ved 250 ° C, og N-methylglucamin eluerer ved 270 ° C.
5. Afledte Validering
- Blødt ionisering LC-ESI-TOF-MS for at identificere molekylære ion, og bestemme molekylvægten af derivatet.
- Brug GC-EI-MS-SIM-eller GC-EI-MSMS for følsomhed forbedring at undersøge målrettede ioner af derivat.
- Brug flere isotopmærkede reagenser til udarbejdelse af de derivater, og derefter bruge massen skiftdisse isotopisk mærkede derivater i MS undersøge molekylær ion og ion-fragmenter.
6. Repræsentative resultater
Protokollen af metoden først og fremmest omfatter fire trin: syre fordøjelse, prøve rensning, derivatisering og GC bestemmelse (figur 1). Et eksempel på en analyse for glucosamin og muramic syre fra standard lagre og fra en jordprøve, er vist i figur 2. Udover glucosamin og muramic syre, mannosamin og galactosamin (to isomerer af glucosamin) kan også bestemmes samtidigt ved anvendelse af fremgangsmåden. Baseret på responsfaktorer af standarder med hensyn til den interne standard myo-inositol, kan vi bestemme disse biomarkører i jordprøver. Genopretning standard er blevet anvendt til kvalitativ overvåge derivatisering processen. Ordningerne til dannelse af aldononitrile acetat derivatiserede glucosamin og muramic syre er vist i figur 3
De foreslåede strukturer af derivaterne blev bestemt ved GC-EIMS-SIM for følsomhed forøgelse eller blød ionisering LC-ESI-TOF-MS 8, de foreslåede strukturer ion fragmenterne dannet ved elektronmikroskopi ionisering blev undersøgt ved at sammenligne ion spektrene for prøver fremstillet med forskellige isotop inkorporering 11. Figur 4 viser massen forskydning af dominerende ion m / z 187 aldononitrile acetat derivatiseret glucosamin i tre scenarier, der er fremstillet med ikke-mærkede midler, D-eddikesyre anhydrit, og U -13 C-glucosamin. Andre detaljerede oplysninger og forklaringer kan blive henvist til vores seneste publikationer 8, 11. Denne strategi kunne tjene som en model til at studere afledt kemi.
Figur 1. Måling flowdiagram af protokollen til analyse af glucosamin og muramic syre i jordenprøver. Protokollen hovedsageligt indeholder 4 trin: Acid fordøjelse, Rensning, Derivatiserinq og GC beslutsomhed.
Figur 2. GC-FID kromatogrammer af aldononitrile acetater af inositol, glucosamin, muramic syre, mannosamin, galactosamin og methylglucamin for standarder og jord.
Figur 3. Skemaer til dannelse af aldononitrile acetat derivatiserede glucosamin og muramic syre. Tallet 1 repræsenterer nitril reaktion. Tallet 2 betegner acetylering.
Figur 4. Massespektre af aldononitrile acetat derivatiseret glucosamin forbundet med den dominerende ion struktues under EI-tilstand fremstilles med (a) ikke-mærkede midler, (B) D-eddikesyre anhydrit, (C) U -13 C-glucosamin. Stjernen betegner tung isotop atom eller isotop-gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fremlagte GC-metode til analyse af aldononitrile acetat derivatiserede glucosamin og muramic syre giver en relativt hurtig metode til at kvantificere disse aminosukkere, udvundet af jord. De derivater er kemisk stabile, og kan bestemmes i en analyse. Metoden er ikke begrænset til jordprøver og kan forenkles for prøver fra ikke-jord matrix.
Vakuumpumpen anvendes i denne fremgangsmåde er designet til at være modstandsdygtig over for syre. Vi foreslog endvidere, at oprette en base fælde for at beskytte de pumper, når fordamper 6M HCl løsninger. Må drages omsorg ved derivatisering skridt til at opretholde strengt vandfrie betingelser for både reagenser og glasvarer. Arbejdet skal udføres uden forsinkelse. Glasapparatur omhyggeligt ren, enten ved dæmpning ved 550 ° C eller ved skylning med opløsningsmiddel. Sikkerhedsforanstaltninger skal tages for håndtering af syrer, og stærke syre dampe under fordampning. Aminoglycosid, enrække af antibiotika produceret af jordbundsorganismer, er blevet identificeret som en mulig interferens, som det co-eluerer med glucosamin eller muramic syre på DB-5 12, så en anden kolonne med en anden stationær fase kemi anbefales, hvis GC-FID er den primære metode til kvantificering af disse aminosukkere. Vi anbefaler en genfremsat detektor efter GC elueres til fremtidig analyse. Til entydig identifikation af spor biomarkør i komplekse matricer, foreslår vi ved hjælp af avanceret instrumentering, fx GC-MSMS med multipel reaktion overvågning, for præcis kvantificering af biomarkør i tilstedeværelse af forstyrrende, foreslår vi laver kalibrering baseret på nogle dominerende masse ioner er unikke for biomarkør derivater.
Bekræftelse af sukker struktur identiteter blev fremstillet ved at substituere 15 N-hydroxylaminhydrochlorid, deutereret eddikesyreanhydrid, og 13 C og / eller 15N mærket biomarkører for ikke-mærket hydroxylaminhydrochlorid, eddikesyreanhydrid og biomarkører ved fremstilling af de derivater, og yderligere overvågning forudsagte m / z forskydning af karakteristiske ioner af det mærkede versus umærkede derivater. I specifikke, da hver af acetat gruppe indeholder 3 deuteriums og hver nitril gruppe indeholder 1 15 N atom kan det forudsiges, at ion m / z masse skift afgøres af, hvor mange acetatgrupper og nitril gruppe vil blive præsenteret i de strukturer ion fragmenter. Tilsvarende, 13C og / eller 15N-mærkning af bakterieceller kan både anvendes til at bestemme, hvor mange carbonatomer i fragmention strukturer stammede fra glucosamin eller muramic syre eller om glucosamin-N-eller muramic syre-N findes i fragment strukturer.
GC-EI-MS-SIM gaskromatografi efterfulgt af elektron impact ionisering og massespektrometri under anvendelse quadropole masse separation og udvalgt ionovervågning; LC-ESI-TOF-MS væskechromatografi efterfulgt af elektrotrospray ionisering og massespektrometri med time-of-flight masse separation. Vi her påpege forskellene mellem disse metoder, der anvendes til at hjælpe med at bestemme den molekylære vægt og ion-fragmenter. ESI-TOF-MS er en "blød ionisering" teknik i ioniseringsenergi bibringes analytmolekyler, der er lavt nok, således at ingen opsplitning forekommer, og det frembragte signal er en meget præcis måling af molekylvægten af analytten. I GC-EI-MS, er mere energi overføres til analytten, og molekylet opbryder gav et antal ladede fragmenter. Den quadropole fungerer som en masse filter, så at kun de fragmenter af en specifik masse / ladningsforhold nå detektoren. Fordelingen af fragmenter, som er karakteristisk for den analyt, der er vist i en graf der kaldes en ion-spektrum, hvori intensitet eller forekomst er afbildet mod m / z. At forøge følsomheden, bruger vi udvalgt ionovervågning (SIM), i hvilket vi programmere MS skal indsamle kun nogle få specifikke m / z-værdier raTher end hele massespektret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra DOE Great Lakes i Bioenergi Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). Vi er taknemmelige for Dr. Xudong Zhang og hans gruppe medlemmer til nyttige tekniske drøftelser og uvurderlige Bemærkninger til færdiggørelsen af protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
