Un método para el control espacio-temporal de la actividad GTPasa pequeña luz se describe. Este método se basa en la rapamicina inducida FKBP-FRB heterodimerización y sistemas de enjaulamiento foto-. Optimización de la luz de la irradiación permite la activación espacio-temporalmente controlada de las pequeñas GTPasas a nivel subcelular.
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Artículo de método
Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas
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Resumen
Resumen
Regulación dinámica de la familia Rho de pequeños triphosphatases guanosina (GTPasas) con una precisión espacial y temporal grande es esencial para varias funciones celulares y los eventos 1 y 2. Su naturaleza dinámica espaciotemporalmente ha sido revelado por la visualización de su actividad y localización en tiempo real 3. Con el fin de obtener un mayor conocimiento de sus funciones en diversas funciones celulares a nivel molecular, el siguiente paso debería ser la perturbación de las actividades de la proteína en un lugar concreto subcelular y el tiempo.
Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un método para la inducida por la luz, espacio-temporalmente la activación controlada de pequeñas GTPasas mediante la combinación de dos técnicas: (1) inducida por la rapamicina FKBP-FRB heterodimerización y (2) un método foto-jaulas de la rapamicina. Con el uso de rapamicina mediada FKBP-FRB heterodimerización, hemos desarrollado un método para la rápida inducible activación o inactivación de pequeño includi GTPasasng Rac 4, 4 Cdc42, RhoA 4 y 5 de Ras, en el que la rapamicina induce la translocación de FKBP fusionados GTPasas o sus activadores, a la membrana plasmática, donde está anclado FRB. Para el acoplamiento con este sistema heterodimerización, también hemos desarrollado un sistema de foto-jaulas de los análogos de rapamicina. Un compuesto foto-enjaulado es una pequeña molécula cuya actividad se suprime con un grupo protector conocido photocleavable como un grupo enjaulamiento. Para suprimir la actividad heterodimerización completamente, hemos diseñado un rapamicina enjaulado que está atado a una macromolécula tal que el gran complejo resultante no puede atravesar la membrana plasmática, que conduce a prácticamente ninguna actividad de fondo como una dimerizer química dentro de las células 6. Figura 1 ilustra un esquema de nuestra sistema. Con la combinación de estos dos sistemas, contratación local un activador de Rac a la membrana plasmática en una escala de tiempo de segundos y alcanzar la luz inducida por la activación de Rac a niveles subcelularEl 6.
Protocolo
1. La transfección de ADN del plásmido
- Añadir ADN de plásmido, 0,5 g de membrana anclada FRB (en adelante, LDR) y 0,5 mg FKBP-Tiam1 (la invasión de las células T linfoma y metástasis de inducción de proteínas 1: Rac activador) marcados con la proteína fluorescente a 37,5 l O. DH 2 Añadir 1 l HD FuGENE.
- Vortex y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Mientras tanto, siga con los pasos 1.3-1.8.
- Lavar cada pocillo de una cámara de 8-bien con 50 l de poli-D-lisina.
- Lavar el centro de cada pocillo con dH 2 O.
- Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 y diluir a 10 ml de medio de cul....
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Discusión
Se describe una técnica que emplea un novedoso compuesto enjaulado junto con el sistema heterodimerización FKBP-FRB con el fin de manipular a la actividad GTPasa Rho en un lugar concreto subcelular en una escala de tiempo de segundos.
Hay tres limitaciones del enfoque actual. En primer lugar, porque el método se basa en la prevención o permitiendo la difusión de dimerizer través de la membrana plasmática, la ubicación de destino celular necesita ser membrana plasmática o sus proximidades. Op.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el NIH financiación de la investigación (DK090868 y GM092930 a TI). No es una patente pendiente en un análogo de la rapamicina enjaulado.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / equipo | Empresa | Número de catálogo | |
| La rapamicina | Tecoland | RAPA99 | |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 | |
| Avidina | Sigma | A9275-10MG | |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML | |
| De exclusión por tamaño de columna | GE Healthcare | Giro Trampa G-25 | |
| Con fondo de cristal y cámara de 8- | Thermo Scientific | 12-565-47 | |
| Microscopio de fluorescencia invertido | Zeiss | Axiovert200M | |
| UV LED fuente de luz | Rapp optoelectrónica | UVILED | |
| Disco giratorio confocal | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 | |
| CCD de la cámara | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER | |
| Lente objetivo 100x | Zeiss | Plan de Apochromat |
Esquema de síntesis de la CRB (Derechos de Autor ACS2011) 6
Condiciones sintéticas: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) de TFA (d) propargílico-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) de glicerol, gato. PTSA, tolueno (f) NaBH 3 CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, piridin (h) metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, piridina, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (L) 8, 2,6-di-t-butilpiridina, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, ascorbato, 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.
Referencias
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M.
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Reimpresiones y permisos
