El protocolo se describe un sistema modelo eficiente y reproducible para estudiar virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) latencia y reactivación. El ensayo emplea cultivos de neuronas simpáticas homogéneos y permite la disección molecular de las interacciones neurona-virus utilizando una variedad de herramientas incluyendo la interferencia de ARN y la expresión de proteínas recombinantes.
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Artículo de método
Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación
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Resumen
Resumen
El virus herpes simple tipo-1 (VHS-1) establece una infección latente de por vida en las neuronas periféricas. Este reservorio latente es la fuente de eventos de reactivación recurrentes que garantizar la transmisión y contribuir a la enfermedad clínica. Antivirales actuales no afectan el depósito latente y no existen vacunas. Si bien los detalles moleculares de la replicación lítica son bien caracterizados, los mecanismos de control de la latencia en las neuronas siguen siendo esquivas. Nuestra comprensión actual de la latencia se deriva de los estudios in vivo con modelos de animales pequeños, que han sido indispensables para definir los requisitos de genes virales y el papel de la respuesta inmune. Sin embargo, es imposible de distinguir efectos específicos sobre la relación de virus neurona de consecuencias más generales de infección mediadas por las células inmunes de apoyo o no neuronales en los animales vivos. Además, la experimentación con animales es costoso, consume mucho tiempo, y limitado en términos de las opciones disponibles para la manipulación de acogidaprocesos. Para superar estas limitaciones, un sistema de neuronas sólo se necesita desesperadamente que reproduce el de las características in vivo de la latencia y reactivación, pero ofrece las ventajas del cultivo de tejidos en términos de homogeneidad y la accesibilidad.
La mayor parte Aquí se presenta un modelo in vitro utilizando cultivos de neuronas simpáticas de rata primaria superior, ganglio cervical (SCG) (Figura 1) para estudiar el VHS-1 de latencia y reactivación que se adapte a si no todos los criterios deseados. Después de eliminar las células no neuronales, casi homogéneas TrkA + cultivos de neuronas están infectadas con HSV-1 en presencia de aciclovir (ACV) para suprimir la replicación lítico. Tras la eliminación de ACV, no productivas las infecciones por HSV-1 que presentan fielmente características aceptadas de latencia se estableció de manera eficiente. En particular, los ARNm líticas, proteínas, y el virus infeccioso hace indetectable, incluso en ausencia de selección, pero asociado a la latencia-transcripción (LAT) expresanión persiste en los núcleos neuronales. Genomas virales se mantienen a un número de copias promedio de 25 por neurona y pueden ser inducidas a replicar productivamente al interferir con la PI3-quinasa / señalización Akt o la simple retirada de factor de crecimiento nervioso 1. Un recombinante VHS-1 EGFP codificación fusionada a la proteína viral lítico US11 proporciona una funcional, en tiempo real para la replicación marcador resultante de reactivación que es fácilmente cuantificado. Además de los tratamientos químicos, metodologías genéticas tales como la interferencia del ARN o el gen de entrega a través de vectores lentiviral puede aplicarse con éxito al sistema de estudios sobre el mecanismo que permite que son muy difíciles, si no imposible, en los animales. En resumen, el SCG-basado en el VHS-1 latencia / reactivación del sistema proporciona una herramienta poderosa, necesaria para desentrañar los mecanismos moleculares que controlan la HSV1 latencia y reactivación de las neuronas, un enigma de larga data en virología, cuya solución puede ofrecer nuevas ideas en el desarrollo de nuevas terapias que objetivo tse reserva latente virus del herpes.
Protocolo
1. Aislamiento y cultivo de neuronas SCG de embriones de rata
Para proporcionar un contexto útil para la comprensión de este protocolo, y para una discusión exhaustiva de la literatura antes que los métodos establecidos de la cultura de las neuronas SCG, incluyendo la base de la CGS en el cultivo in vitro, el revestimiento de sustratos de placas, y los componentes del suero libre de los medios de comunicación, la se remite a las referencias 2-4.
- El uso de ratas como una fuente para las neuronas SCG se realizó de conformidad con las directrices de los NIH en virtud de un protocolo activo aprobado por el
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Discusión
Esta cultura de la neurona y el sistema de la infección primaria proporciona un método simple y eficaz para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a HSV-1 de latencia y reactivación. El sistema fielmente recapitula los punzones aceptados de latencia definidos, tanto en infecciones humanas y en modelos de animales vivos. Cuando el virus está latente en los cultivos SCG, las partículas virales infecciosas y productos génicos líticas no puede ser detectada. El único producto del .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos a los revisores por sus sugerencias reflexivas que ayudaron a mejorar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas a MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) y la mensajería instantánea (AI073898, GM056927) de los NIH. MK fue apoyado en parte por una subvención del NIH formación (5T32 AI007180).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Empresa | Catálogo # | Comentarios |
| 70μm filtro de nylon (filtro de células) | BD Biosciences | 352350 | |
| Solución Salina Equilibrada de 1x de Hank (HBSS - / -) | Invitrogen | 14175 | w / o CaCl 2 y MgCl 2 |
| 1x Medios de Comunicación Esencial Mínimo (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-fluoro-2'-desoxiuridina | Sigma | F0503 | preparar a 20 mM de existencias en 1x MEM; almacenar a -20 ° C |
| Plano de 96 y placas de fondo de cooperación técnica | Corning | 3599 | |
| Aciclovir | Calbiochem | 114798 | preparar 31 mM de existencias en DMSO; almacenar a -20 ° C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | preparar 10 mM de existencias en DMSO; almacenar a -20 ° C |
| B-27 Suplemento | Invitrogen | 17504-44 | |
| Colagenasa | Sigma | C2674 | preparar a 10 mg / ml de caldo en HBSS - / -; almacenar a -20 ° C |
| D-(+)-glucosa | Sigma | G6152 | preparar a un 40% de valores en H 2 O, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030-081 | |
| La laminina | Sigma | L2020 | preparar a 1 mg / ml de caldo de H2O; congelar rápidamente 20 laliquats y almacenan a -80 ° C; diluido a 2 mg / ml de HCl conc trabajo. en el H 2 O estéril |
| Leibovit'z L-15 los medios de comunicación | Invitrogen | 11415 | |
| Factor de crecimiento nervioso | Harlan Laboratorios | BT.5017 | preparar a 50 mg / ml de caldo en HBSS - / -; se almacena a -80 ° C |
| Medio Neurobasal | Invitrogen | 12348 | |
| Fosfonoacético ácido (PAA) | Sigma | P6909 | preparar a 75 mg / ml de caldo de H 2 O, almacenar a -20 ° C |
| Poli-D-lisina hidrobromuro | Sigma | P0899 | preparar a 20 mg / ml de caldo de H 2 O, almacenar a -20 ° C |
| De cola de rata colágeno | Millipore | 08-115 | La concentración varía con mucha oferta, se almacena a 4 ° C y se diluye a 0,66 mg / ml concentrado de trabajo. en el H 2 O estéril |
| Tricostatina A | Sigma | T8552 | preparar 1 mM de existencias en DMSO; almacenar a -20 ° C |
| Tripsina 2,5% | Invitrogen | 15090-04 |
Referencias
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia.
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Reimpresiones y permisos
