Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.
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Artículo de método
Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
En este artículo
Resumen
Resumen
Los microARN (miRNA) son de cadena sencilla, 18-24 nucleótidos de largo, no codificantes moléculas de ARN. Ellos están involucrados en prácticamente todos los procesos celulares incluyendo el desarrollo de 1, 2 la apoptosis y la regulación del ciclo celular 3. MiRNAs se estima que regulan la expresión de 30% a 90% de los genes humanos 4 mediante la unión a sus ARNs diana mensajero (ARNm) 5. La desregulación generalizada de los miRNAs se ha informado en diversas enfermedades y subtipos de cáncer 6. Debido a su prevalencia y la estructura única, estas pequeñas moléculas tienden a ser la próxima generación de biomarcadores, agentes terapéuticos y / o objetivos.
Los métodos utilizados para investigar la expresión de miRNA son SYBR Green I con base de tinte, así como Taqman-qPCR basado en la sonda. Si los miRNAs se utiliza con eficacia en el ámbito clínico, es imprescindible que su detección en muestras clínicas frescas y / o archivados ser exacto, reproducible, y specific. qPCR ha sido ampliamente utilizado para la validación de expresión de miRNAs en los análisis de todo el genoma, tales como estudios de microarrays 7. Las muestras utilizadas en este protocolo fueron de pacientes que se sometieron a prostatectomía radical por cáncer de próstata clínicamente localizado, sin embargo otros tejidos y líneas celulares se pueden sustituir in biopsias de próstata fueron broche de congelados en nitrógeno líquido después de la resección. Las variables clínicas y la información de seguimiento para cada paciente se recogieron para su análisis posterior 8.
La cuantificación de los niveles de miRNA en muestras de tumores de próstata. Los pasos principales en el análisis de qPCR de los tumores son: extracción de RNA total, síntesis de ADNc, y la detección de productos específicos qPCR utilizando miRNA-cebadores. El ARN total, que incluye mRNA, Mirna, y otros pequeños RNAs fueron extraídos de las muestras con el reactivo TRIzol. Sistema de Qiagen miScript fue utilizado para sintetizar cDNA y realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos no son polyadenylated, tanto durante el proceso de transcripción inversa, un poli (A) polimerasa polyadenylates el miARN. El miARN se utiliza como una plantilla para sintetizar cDNA utilizando oligo-dT y la transcriptasa inversa. Una secuencia de etiqueta universal en el extremo 5 'de los cebadores de oligo-dT facilita la amplificación de cDNA en el paso de PCR. Amplificación por PCR producto es detectado por el nivel de fluorescencia emitida por SYBR Green, un colorante que se intercala en el ADN de doble cadena. Cebadores específicos miARN, junto con una imprimación universal que se une a la secuencia de etiqueta universal amplificar secuencias específicas miARN.
Los ensayos Primer miScript están disponibles para más de un millar de miRNAs específicos de los humanos, y cientos de ratón específicos de miRNAs. Método de cuantificación relativa se utiliza aquí para cuantificar la expresión de miRNAs. Para corregir la variabilidad entre las diferentes muestras, los niveles de expresión de un miARN objetivo se normaliza a los niveles de expresión de un gen de referencia. La elección de un GEne en que para normalizar la expresión de los objetivos es crítico en el método de cuantificación relativa de análisis. Ejemplos de genes de referencia típicamente utilizados en esta capacidad son la RNU6B ARN pequeño, RNU44, y RNU48 ya que se consideran para ser expresado de forma estable en la mayoría de las muestras. En este protocolo, RNU6B se utiliza como el gen de referencia.
Protocolo
1. Recogida de muestras de próstata
- Recoger las muestras de la próstata en el momento de la prostatectomía. La muestra se orienta utilizando puntos de referencia anatómicos. La próstata y las vesículas seminales están pintadas de la siguiente manera: verde, lado derecho, lado izquierdo azul.
- Una sección media transversal al azar de la próstata se toma perpendicularmente a la superficie rectal, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C 9.
- Rebanadas de muestras depositadas son fotocopias, orientado (anterior, posterior, derecha e izquierda), quadrisected. Las secciones se cortan con el criostato.
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Discusión
Expresiones aberrantes de algunos miRNAs han sido encontrados en los tumores de próstata en comparación con el tejido normal de 10, y algunos de estos miRNAs han sido mencionados como potenciales nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer de próstata 11. Por lo tanto los niveles de expresión de miRNAs aberrantes pueden ser útiles biomarcadores de diagnóstico y / o pronóstico. La metodología qPCR en tiempo real se presenta aquí proporciona un ensayo para la cuantificación exacta de los niveles de .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Canadiense del Cáncer del Instituto de Investigación, conceder ninguna. 019038.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Kit de transcripción reversa | Qiagen | 218061 | |
| Los ensayos miScript Primer | Qiagen | Experimento específica | |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Light Cycler capilares | Roche | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 espectrofotómetro | Thermo Scientific | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
Referencias
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790(2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M.
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