Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

Resumen

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.

Resumen

El método convencional para identificar y clasificar los cromosomas individuales depende del patrón único de bandas de cada cromosoma en una especie en particular se analizaron ^{1, 2.} Esta técnica clásica anillamiento, sin embargo, no es fiable en la identificación de complejos aberraciones cromosómicas tales como aquellas asociadas con el cáncer. Para superar las limitaciones de la técnica de bandeo, cariotipo espectral (SKY) se introdujo para proporcionar mayor cantidad de información fiable sobre las anomalías cromosómicas.

SKY es una fluorescencia multicolor de hibridación in situ (FISH) para detectar los cromosomas en metafase con el microscopio espectral de ^{3, 4.} SKY ha sido demostrado ser una herramienta valiosa para el análisis citogenético de una amplia gama de anomalías cromosómicas asociadas con un gran número de enfermedades genéticas y enfermedades malignas ^{5, 6.} CIELO implica el uso de sondas de ADN multicolores fluorescentemente-etiquetados preparados a partir de la oligonucleótidos degeneradoscebadores otide por PCR. Así, cada cromosoma tiene un color único espectral después de hibridación in situ con sondas, que están diferencialmente etiquetados con una mezcla de tintes fluorescentes (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC y Cy5.5). Las sondas utilizadas para SKY constar de hasta 55 sondas cromosómicas específicas ^7-10.

El procedimiento para SKY implica varios pasos (Figura 1). CIELO requiere la disponibilidad de células con alto índice mitótico a partir de tejido normal o enferma o sangre. Los cromosomas de una sola célula a partir de ya sea un celular recién aisladas primaria o una línea celular se extienden sobre un portaobjetos de vidrio. Esta propagación cromosoma está etiquetado con una combinación diferente de tintes fluorescentes específicas para cada cromosoma. Para la detección de la sonda y la adquisición de imágenes, el sistema de imagen espectral consta de interferómetro de Sagnac y una cámara CCD. Esto permite la medición del espectro de luz visible emitida desde la muestra y para adquirir una imagen espectral vaivénm individuales cromosomas. HiSKY, el software utilizado para analizar los resultados de las imágenes capturadas, proporciona una fácil identificación de anomalías cromosómicas. El resultado final es una metafase y una imagen de clasificación cariotipo, en el que cada par de cromosomas tiene un color distinto (Figura 2). Esto permite una fácil identificación de las identidades cromosoma y translocaciones. Para más información, visite el sitio web Aplicada Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY se utilizó recientemente para la identificación de los defectos de la segregación cromosómica y las anomalías cromosómicas en humanos y ratones con autosómica dominante renal poliquística (PQRAD), una enfermedad genética que se caracteriza por una disfunción en los cilios primarios ^11-13. Usando esta técnica, hemos demostrado la presencia de la segregación cromosómica anormal y anomalías cromosómicas en pacientes PQRAD y modelos de ratón ¹⁴. Los análisis adicionales utilizando SKY no sólo nos permitió identificar el número cromosómico y la identidad, sino también para detectar con precisión las aberraciones cromosómicas muy complejas, tales como deleciones y translocaciones cromosómicas (Figura 2).

Protocolo

1. De la célula pre-tratamiento y preparación de la metafase

1. Las células se cultivan en modif Dulbecco de Medio Eagle (DMEM) que contiene 10-15% de suero fetal bovino (SFB) y 1% penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO ₂ incubadora, hasta que alcanzan 70-80% de confluencia.
2. Se tratan las células con solución colcemid a 0,05 ug / ml para 30-60 min.
3. Se recoge el medio que contiene las células flotantes en 50 ml tubos de centrífuga estériles de halcón. Lavar las células en el plato con sterile1X-PBS. Después de incubar con tripsina estéril para 1-2 min, se cosecha y recoger las células restantes en el mismo tubo.
<....

Discusión

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética utilizada en el estudio de las composiciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, y la detección de estas sondas son adquiridos a través de un interferómetro de Sagnac. El proceso de SKY completa generalmente toma alrededor de una semana, e implica varios pasos clave (Figura 1). El SKY utiliza un protocolo estándar, el cual fue descrito por primera vez por Padilla-Nash et al ^3.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Cellgro Mediatech Inc.	10 a 013 CV
De suero fetal bovino (SFB)	Hyclone	SH30088-03
Penecillin / estreptomicina	Thermo Scientific	SV30010
Colcemid	Roche Diagnostics	10 295 892 001	10 g / ml
De HCl	Fisher Scientific	A144-500
KCl	Fisher Scientific	S77375-1
Fosfato solución salina tamponada	Thermo Scientific	SH30256-01
SKY pintura Sonda (Humana)	Imágenes Applied Spectral	SKY000028
SKY pintura Probe Kit (Mouse)	Imágenes Applied Spectral	SKY000030
Concentrado kit de detección de anticuerpos	Imágenes Applied Spectral	SKY000033
Tripsina	Thermo Scientific	SH30236.01
El metanol	Fisher Scientific	A433P-4
El ácido acético	Fisher Scientific	A38-212
RNasa A	Roche Diagnostics	10 109 169 001
Pepsina	Sigma-Aldrich	P6887-5G
MgCl 2	Fluka	63069-500ML
37% El formaldehído	Mallinckrodt Baker	2106-02
SSC 20X	Promega	V4261
Formamida	Fluka	47671	preparar justo antes de usarse
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-549
Microscopio cubierta de vidrio 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Adhesivo de goma	Elmer (tienda local)
Hibridación / humidifiedchamber / bandeja	Simport	M920-2	poner las toallas de papel mojadas en la parte inferior
Thermociclista	Eppendorf	Epgradient S
Plataforma de agitación / Agitador orbital	Bellco Biotecnología
Baño de agitación / agua	Precisión Científico
DAPI filtro de cubo	Chroma Technology
SKY filtro de cubo	Chroma Technology
SpectraCube	Imágenes Applied Spectral
Celular microscopio invertido la cultura	Nikon	Nikon Eclipse TS100
Microscopio de fluorescencia	Olimpo	IX70	Aceite de 60X