El ensayo de depuración mesotelial se describe aquí se aprovecha de las células de la etiqueta fluorescente y time-lapse microscopía de vídeo para visualizar y medir cuantitativamente las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales. Este ensayo permite simular las primeras etapas de la metástasis del cáncer de ovario.
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Artículo de método
Ensayo in vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico
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Resumen
Resumen
El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos 1. A pesar de una respuesta inicial positiva a las terapias, del 70 al 90 por ciento de las mujeres con cáncer de ovario desarrollan metástasis a los nuevos, y la recurrencia es a menudo fatal 2. Es, por tanto, necesaria para entender cómo surgen metástasis secundarias con el fin de desarrollar mejores tratamientos para el cáncer de ovario en etapa intermedia y tardía. La metástasis del cáncer de ovario ocurre cuando las células malignas se desprenden de la localización del tumor primario y difundir toda la cavidad peritoneal. Las células diseminadas pueden formar grupos multicelulares, o esferoides, que o bien permanecerá sin conectar, o implantes en órganos dentro de la cavidad peritoneal 3 (Figura 1, la película 1).
Todos los órganos dentro de la cavidad peritoneal se revisten con una sola capa continua, de las células mesoteliales 4-6 (Figura 2). Sin embargo, las células mesoteliales están ausentes de debajolas masas tumorales peritoneales, como lo revelan los estudios de microscopio electrónico de secciones de tejidos humanos extirpados tumores 3,5-7 (Figura 2). Esto sugiere que las células mesoteliales se excluyen de debajo de la masa tumoral por un proceso desconocido.
Anterior en experimentos in vitro han demostrado que las células primarias de cáncer de ovario adjuntar más eficientemente a la matriz extracelular que a las células mesoteliales 8, y los estudios más recientes demostraron que las células primarias mesoteliales peritoneales realmente proporcionar una barrera para la adhesión celular de cáncer de ovario y la invasión (en comparación con la adhesión y la invasión sobre soportes que no fueron cubiertas con células mesoteliales) 9,10. Esto sugeriría que las células mesoteliales actuar como una barrera contra la metástasis de cáncer de ovario. Los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las células de cáncer de ovario incumplan esta barrera, y no incluyen el mesotelio, hasta hace poco, sigue siendo desconocido.
A continuación se describe ºmetodología e para un ensayo in vitro que los modelos de la interacción entre los esferoides de ovario de células cancerosas y las células mesoteliales in vivo (Figura 3, la película 2). Nuestro protocolo es una adaptación de los métodos descritos anteriormente para el análisis de las interacciones de células de tumor de ovario con monocapas mesoteliales 8-16, y fue descrito por primera vez en un informe que muestra que las células tumorales de ovario utilizar una activación de la integrina-dependiente de la miosina y la fuerza de tracción para promover la exclusión de la las células mesoteliales de debajo de un esferoide del tumor 17. Este modelo toma ventaja de la microscopia de fluorescencia de lapso de tiempo para controlar las poblaciones de células de dos en tiempo real, proporcionando la información espacial y temporal de la interacción. Las células de cáncer de ovario expresan la proteína fluorescente roja (RFP), mientras que las células mesoteliales expresan la proteína verde fluorescente (GFP). RFP-expresando ovario esferoides celulares de cáncer de adjuntar a la monocapa mesotelial que expresan GFP. La difusión esferoides, invadir yforzar a las células mesoteliales lado creando un agujero en la monocapa. Este agujero se visualiza como el espacio negativo (negro) en la imagen de las buenas prácticas agrarias. El área del agujero se puede medir a analizar cuantitativamente diferencias en la actividad holgura entre el control y las poblaciones experimentales de cáncer de ovario y / o células mesoteliales. Este ensayo requiere sólo un pequeño número de células de cáncer de ovario (100 células por esferoides X 20-30 esferoides por condición), por lo que es factible realizar este ensayo utilizando preciosas muestras primarios de células tumorales. Además, este ensayo se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.
Protocolo
1. Cáncer de ovario de la célula Esferoide Formación
- PP-expresando las células de cáncer de ovario se cultivan en medio de base 10% (un medio de cultivo celular personalizada que contiene una mezcla 50:50 de 199 y MCDB105, 10% suero bovino fetal inactivado y 1% de lápiz estreptococo). Para expresar RFP en las células de cáncer de ovario no etiquetados, transfectar las células con un plásmido que contiene solicitud de propuestas y seleccionar las células que expresan RFP. Alternativamente, los vectores virales pueden ser utilizados para expresar transitoriamente proteínas fluorescentes, o las células pueden ser pre-incuban con un color rojo fluorescente de ....
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Discusión
El "Ensayo de Liquidación mesoteliales" que aquí se presenta utiliza lapso de tiempo de microscopía para controlar las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales, con gran detalle espacial y temporal. Anteriormente, varios grupos de 8-14 había utilizado los ensayos de punto final para demostrar que las células de cáncer de ovario y de adherirse a invadir en monocapas de células mesoteliales. Este ensayo es único en que utiliza células marca.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a la Nikon Imaging Center de la Harvard Medical School, en concreto las aguas de Jennifer, Lara Petrak y Salmón Wendy, para la formación y el uso de microscopios sus timelapse. También nos gustaría dar las gracias a Rosa Ng y Besser Achim valiosa para los debates. Este trabajo fue apoyado por el NIH Grant 5695837 (a M. Iwanicki) y GM064346 de ACC, por una beca de la Dra. Miriam y Sheldon G. Adelson Fundación de Investigación Médica (con ACC).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| OVCA433 células de cáncer ovárico | Regalo del Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT células mesoteliales | Regalo del Dr. Tan Ince | ||
| Medio 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Aplicaciones de la célula Inc. | 117-500 | |
| FBS-inactivado por calor | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| Placas de 96 pocillos | Corning Costar | 3799 | |
| Polihidroxietilmetacrilato (poli-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | Para poli-HEMA solución disolver 6mg poli-HEMA polvo en 1 ml de EtOH al 95% |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Diluir al 95% en dH 2 0 |
| Celular campana de la cultura | Nuaire | NU-425-300 | |
| Cultivo de tejidos incubadora | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubadora de poli-HEMA placas | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Centrífuga de mesa | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 y plato de fondo de vidrio | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| La fibronectina | Sigma | F1141-1mg | |
| PBS | Cellgro | 21 a 040 CV | |
| Timelapse microscopio: | |||
| Microscopio | Nikon | Ti-E invertida motorizada de fluorescencia microscopio de lapso de tiempo con el sistema integrado de enfoque perfecto | |
| Lente | Nikon | 20X-0.75 apeture numérica | |
| Halógeno transiluminador | Nikon | 0.52 NA larga jornada de trabajo del condensador a distancia | |
| Filtros de excitación y emisión | Chroma filtros de una sola pasada en la vivienda de Nikon | Las buenas prácticas agrarias Ex 480/40, Em 525/50 SP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitido y Epifluoresce trayectoria de la luz | Sutter | Persianas inteligentes | |
| Lineal codificado platina motorizada | Nikon | ||
| Refrigerado de carga acoplada dispositivo de cámara | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscopio cámara de incubación con 2 temperatura y el control de CO | hecha a la medida | ||
| Vibración mesa de aislamiento | TMC | ||
| NIS-Elements | Nikon | La versión 3 |
Referencias
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M.
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Reimpresiones y permisos
