Artículo de método

Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear

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DOI:

10.3791/3891

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20 de febrero de 2013

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

En este artículo

Resumen

Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de etiquetado 18 O-agua enriquecida (Leo-flujos de trabajo) son herramientas versátiles para estudios de proteómica cuantitativa y cualitativa. En los flujos de trabajo asistidas proteasa-(paleo), 18 Átomos de O son introducidos por la escisión proteolítica y carboxilo reacciones de intercambio de oxígeno mediada por proteasas. En el catalizada por ácido (Aleo) flujo de trabajo, 18 Átomos de O son introducidos por intercambio de oxígeno carboxilo a pH bajo.

Resumen

Los isótopos estables son herramientas esenciales en la espectrometría de masa biológica. Históricamente, 18 O-isótopos estables se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos catalíticos de enzimas proteolíticas 1-3. Con el advenimiento de la espectrometría de masas basado proteómica, la incorporación catalizada enzimáticamente de 18 átomos de O de agua estable enriquecido isotópicamente se ha convertido en un método popular para comparar cuantitativamente los niveles de expresión de proteína (revisado por Fenselau y Yao 4, Miyagi y Rao 5 y Ye et al. 6). 18 O-etiquetado constituye una alternativa simple y de bajo costo a los productos químicos (por ejemplo, iTRAQ, ICAT) y metabólicos (por ejemplo SILAC) técnicas de marcado 7. Dependiendo de la proteasa utilizada, 18 O-etiquetado puede dar lugar a la incorporación de hasta dos 18 átomos de O en el grupo carboxilo C-terminal del producto de escisión 3 8. En nuestro Paleo (p rotease-a e l Abeling ssisted mploying 18 O agua enriquecida) la adaptación enzimática de 18 O-etiquetado, se utilizó 50% 18 O enriquecida con agua para producir firmas isotópicas distintivas. En combinación con la alta resolución de láser asistida por matriz de ionización de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masas tándem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), los sobres de isótopos característicos se puede utilizar para identificar los productos de escisión con un alto nivel de especificidad. Anteriormente ha utilizado el paleo-metodología para detectar y caracterizar proteasas endógenas 9 y controlar las reacciones proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica la esencia misma de la reacción de escisión proteolítica, el montaje experimental es enri sencillo y bioquímicospasos chment de productos de escisión se puede evitar. El paleo-método se puede extender fácilmente a (i) experimentos de tiempo de los cursos que controlan la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica y (ii) el análisis de la proteólisis en muestras biológicas complejas que representan las condiciones fisiológicas. Paleo-timecourse experimentos ayudan a identificar limitación de la velocidad de procesamiento y pasos intermedios de reacción en situaciones complejas de reacciones proteolíticas vía. Además, el paleo-reacción nos permite identificar las enzimas proteolíticas tales como la tripsina proteasa de serina que es capaz de volver a enlazar sus productos de escisión y catalizar la incorporación de un segundo átomo de O 18. Tales "doble etiquetado" enzimas se pueden utilizar para postdigestion 18 O-etiquetado, en la que los péptidos están etiquetados exclusivamente por la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. Nuestra tercera estrategia se extiende etiquetado empleando 18 O agua enriquecida más allá de las enzimas y utiliza las condiciones ácidas de pH para introducir 18 O-isótopo estable signoturas en péptidos.

Protocolo

Los flujos de trabajo presentados Leo-permitir el etiquetado de isótopos estables de proteínas digiere y péptidos sintéticos. Estos experimentos de tiempo (Figura 1) son aplicables a los estudios de proteómica comparativa y cuantitativa así como la investigación de proteasa. Cada flujo de trabajo consta de dos pasos experimentales (Figura 2): A) El tiempo de muestreo resuelto de la respectiva 18 O-isótopos estables codificada reacción (proteasa de escisión catalizada por péptido; proteasa catalizada carboxilo reacción de intercambio de oxígeno; catalizada por ácido intercambio de oxígeno carboxilo reacción) y análisis B) por espectrometría de masas y la representación gráfica de 18-O incorporación cinética.

A. Experimentos timecourse

I. paleo-timecourse: Proteasa catalizada etiquetado de escisiones proteolíticas

  1. (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM)en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparada) por incubación durante 30 min a 50 ° C.
  2. (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Use PepClean columnas C-18 spin (Thermo) para la limpieza de péptido y Vivaspin concentradores centrífugos (Sartorius) para el intercambio de tampones para muestras de proteínas.
  4. Volver a disolver / péptidos / proteínas de cambio en 20 l tampón de reacción de la proteasa (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de la proteasa: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámicomatriz de ácido (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Extender la muestra en un Opti-TOF 384 placa de MALDI objetivo (AB SCIEX) y dejar que las gotas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 minutos).
  6. Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con la proteasa de interés (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como muestra de control. La primera alícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por O-18 etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y la identificación de proteínas, detección de las actividades proteolíticas y seguimiento de las reacciones de escisión proteolítica. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es inducida por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado ni escisión se espera para esta muestra.
  7. Siga la reacción mediante la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como described del paso 5 a intervalos de tiempo como parece conveniente. Las condiciones de reacción descritas anteriormente se utilizan para controlar una reacción proteolítica para hasta cuatro días (aproximadamente 24 puntos). Iniciar el muestreo cada 5 min hasta 30 min, luego detectar cada 30 min hasta 2 h, después cada hora hasta 8 horas y cada 8 h hasta 4 días. Productos de escisión debe aparecer dentro de las primeras 12 horas y el sustrato debe estar completamente hidrolizada después de 24 horas. Tiempos de incubación prolongados de reacción permiten definir los productos de reacción que son estables discreta a partir de intermedios de reacción, que son objeto de transformación. Dependiendo de la pregunta de investigación y dados pares enzima-sustrato, los tiempos y temperaturas de incubación manchado tiene que ser modulada para asegurar el muestreo reacción óptima.
  8. Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas, la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B).

II. Paleo-timecourse: Postdigestion etiquetado de termini proteolíticas

  1. (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparado) por incubación durante 30 min a 50 ° C.
  2. (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Utilice columnas PepClean C-18 para la limpieza de spin péptido y Vivaspin concentradores centrífugos para el intercambio de proteína buffer.
  4. Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos / proteínas en 20 l tampón de reacción de la proteasa (por ejemplo tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) y se digiere con proteasa de interés para la terminación (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM; 37 ° C; 12 hr).
  5. Productos de limpieza de escisión con columnas PepClean C-18 espín. Este paso eliminará las actividades residuales de proteasa.
  6. Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos en tampón de 20 l reacción de la proteasa (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O.
  7. Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de enzima: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Punto de la muestra en una placa diana MALDI y dejar las gotitas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 min).
  8. Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con proteasa de interés (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como un control. La primeraalícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por 18 O-postdigestion etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y cuantificación de proteínas. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es catalizada por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado se esperaba para esta muestra.
  9. Seguir la reacción por la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como se describe en el paso 7.) A intervalos de tiempo como parece conveniente. Por ejemplo, hemos descubierto inicialmente cada 5 minutos durante hasta 30 min y cada 15 min después de que para controlar la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo catalizada por tripsina.
  10. Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas de la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B).

III. Aleo-timecourse: catalizada por ácido etiquetado de grupos carboxilo

  1. Incubar péptidos individuales (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-agua enriquecida en tél presencia o ausencia (control) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético definitiva (volumen total de 30 l).
  2. Muestra los productos de reacción al día durante 48 días por co-spotting una alícuota de 0,5 l de la mezcla con 0.5μl matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) directamente en una diana MALDI plato.
  3. Entre los intervalos de aplicación, y después de ver el punto de reacción por última vez presentar placa MALDI objetivo para MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe a continuación en la Sección B.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de adquisición de datos y análisis

  1. Los espectros de masas se adquieren en un 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
  2. Antes del análisis, el instrumento se calibra con una mezcla de péptidos estándares (Kit de estándares de masa para la calibración de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) con una tolerancia de error de masa máxima de medición de ± 50 ppm y un número mínimo de seis picos para que coincida.
  3. MS espectros (rango de masas400 - 4.000 m / z) son adquiridos por triplicado utilizando el modo de ion positivo con una intensidad de láser ajustable (3.400 - 3.800; tamaño de paso 50) con un rango de intensidad de base aceptable pico de 2.000 - 45.000. TOMA DE hayan sido adquiridos con sub-espectros, con 400 golpes totales / espectro, deje de condiciones entrarán en vigor después de 800 sub-espectros se adquieren (aprobado o suspenso) o 400 espectros sub-criterios de aceptación de pase. En caso de poco abundantes muestras o en presencia de complejos orígenes biológicos el extremo inferior del rango de detección MS debería elevarse a 800 m / z. Además, puede ser necesario para eliminar la sal y otros compuestos que interfieren con un paso de limpieza de la muestra como se ha descrito anteriormente o mediante la separación LC.
  4. MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde el 4000 Series software de adquisición de datos y el Explorador de importación en nuestro propio sistema de información de laboratorio, que utiliza software MASCOTA Distiller (Matrix Science) para el procesamiento espectral y detección de picos. Sobres isotópicosson desconvolucionado y 18 O-incorporación coeficientes determinados automáticamente usando un algoritmo similar a la descrita por Mason et al. 12 y adaptada por nuestro grupo 9. Alternativamente, las herramientas de software, tales como ZoomQuant 13 y Viper 14, así como paquetes de software comerciales tales como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) y cuantificación Mascot Distiller Toolbox (Matrix Science) puede deconvolute 18 O-tipo de datos 15,16. 18 O-incorporación relaciones se expresan como las contribuciones relativas de las distintas especies de isótopos de péptidos (es decir, los péptidos que contienen 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) a la envolvente isotópica entero.
  5. Para cada experimento timecourse, las masas moleculares ([M + H] +) para todas las especies de péptidos detectados son extraídos de los archivos asociados de datos de MS y los valores agrupada en una anchura de 100 ppm en masa.
  6. Lal menos tres [M + H] + se fijan para ser requerido para llenar un contenedor. En caso de sustratos conocidos, la lista bin filtrada se compara con una lista de los productos de escisión proteolítica predecir a partir de la secuencia del péptido sustrato utilizando la herramienta ExPASy FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) y un 200 ppm en masa error de tolerancia de aceptación.
  7. MS / MS espectros se adquieren para todos los valores de masa de los productos de escisión predichos por la herramienta FindPept y para valores en intervalos que tienen 18 O-incorporaciones asociados con ellos. MS / MS datos se adquieren en el 4800 MALDI TOF / TOF Analizador 1kV en modo reflector de iones positivos, con una intensidad del láser fijo de 4200 y CID-gas en el modo de apagado. 50 disparos se adquieren en un patrón aleatorio por sub-espectro, hasta un total de 40 sub-espectros por punto (lo que da un total de 2.000 disparos / in situ).
  8. MS / MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde la Explo 4000 Seriesrer software de adquisición de datos e importados en nuestro propio sistema de información de laboratorio, se detectan los picos y MS / MS de las listas de pico están asociados con los correspondientes datos de MS agrupadas.
  9. Para la identificación de péptidos, MS / MS listas de los picos se registraron en contra de la base de datos SwissProt utilizando el motor de búsqueda MASCOT con los siguientes parámetros de búsqueda: ninguna especificidad enzimática, 150 ppm de ion precursor y 0,2 Da tolerancias de iones de fragmentos de masa.
  10. Péptido identificaciones, además, puede ser validada usando el software Data Explorer (AB SCIEX) confirmando las características 18 O-incorporación patrones a través de los fragmentos de iones y de la serie según lo descrito por Shevchenko et al. 18.

C. Preparación del Tiempo espectral y 18 parcelas incorporación O-

Diagramas espectrales de tiempo: MS archivos de datos (. DT2 archivos) para cada punto de tiempo de reacción se exportan desde el software del explorador de datos como ASCII-archivos usando unamacro e importados a un análisis de datos y el programa de software gráfico (por ejemplo, por OriginLab origen) y se muestran como gráficos de cascada (figura 3).

18 O-incorporación parcelas: Para cada producto de división del péptido binned, las contribuciones relativas de las distintas especies de péptidos de isótopos (16 O, 18 O 18 O 1 o 2) se extraen a través de todos los puntos de tiempo de reacción y en función del tiempo (Figura 4).

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Resultados

Se utilizó el flujo de trabajo de paleo-timecourse para controlar dinámicamente la incorporación de 18 O-isótopos estables en productos de división de péptidos generados por las enzimas proteolíticas. El enfoque que se presenta es una herramienta versátil para estudiar comparativamente las vías proteolíticas procesamiento de sustrato diferente y combinaciones de la proteasa. Mediante el muestreo de reacciones proteolíticas repetidamente en el transcurso de la reacción, el experimento paleo-timecourse ofrece i...

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Discusión

Mediante la combinación de etiquetado de isótopos estables y de alta resolución de la espectrometría de masas en una manera resuelta en el tiempo, el método de paleo-timecourse permite un análisis dinámico de la generación de productos peptídicos. El ensayo se puede utilizar para generar péptidos marcados con isótopos estables para estudios de proteómica cuantitativos y cualitativos, y para evaluar la cinética por el que los péptidos proteotípicos se generan. Además, paleo-timecourse está diseñado para evaluar las vías ...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR subvención 1R01DE019796.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del material Empresa Número de catálogo
PepClean C-18 spin columnas Thermo 89870
Opti-TOF 384 MALDI tablilla de puntería AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF / TOF AB SCIEX

Tabla 1. Materiales

Nombre de reactivo Empresa Número de catálogo
Alfa ciano-4-hidroxicinámico Sigma Aldrich 70990-1G-F
Albúmina de suero bovino (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Ditiotreitol (DTT) Acros 16568-0050
Yodoacetamida (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
Conversión de la endotelina enzima-1 (ECE-1) R & D Systems 1784-ZN
Tripsina Oro Promega V5280
Water-18 O, 97% atómico 18 O Sigma Aldrich 329878-1G
Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) Thermo 28904
Normas Kit Misa para la calibración de AB Sciex TOF / TOF instrumentos AB SCIEX 4333604

Tabla 2. Reactivos

Referencias

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