Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el material genómico que es adecuado para la secuenciación.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando "Genómica solo virus '
En este artículo
Resumen
Resumen
Amplificación del genoma entero y secuenciación de las células microbianas individuales permite la caracterización genómica y sin la necesidad de cultivo de 1-3. Los virus, que son muy abundantes y las más numerosas entidades en nuestro planeta 4 e importante en todos los ambientes, 5 aún no se han puesto de manifiesto a través de enfoques similares. A continuación se describe un método para el aislamiento y la caracterización de los genomas de los viriones single llamado "Genómica Virus única» (SVG). SVG utiliza citometría de flujo para aislar los virus individuales y de todo el genoma de amplificación para obtener ADN genómico de alto peso molecular (gDNA) que se puede utilizar en reacciones de secuenciación posteriores.
Protocolo
1. Preparación de suspensiones virales
Antes de aislamiento de viriones individuales a través de citometría de flujo, preparar suspensiones virales no fijadas.
- Aislar partículas virales mediante protocolos previamente establecidos que hacen suspensión viral definitiva que figura en 0.1 micras con filtro TE (Tris-EDTA, pH 8). Se recomienda el uso de filtración de flujo tangencial (TFF) se aproxima a 6 aunque otros métodos han sido desarrollados para el uso de químicos de floculación 7.
- Enumerar las partículas virales mediante protocolos establecidos, por ejemplo, utilizando 8-10
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Un número de factores importantes que hay que tener en cuenta a la hora de aplicar enfoques SVG. Genotipificación, como se lleva a cabo durante el experimento de prueba de concepto 13, no es una opción válida para aislamientos ambientales o desconocidos como cebadores conservados no están disponibles en todos los grupos virales. Además, el fondo síntesis de ADN o la amplificación no específica se ha divulgado durante la amplificación mediante la reacción de MDA 14. Amplificación no específica se ha.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Ken Nealson por su visión y asesoramiento durante todo el proceso de preparación de manuscritos.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Buffer TE 1X | Invitrogen | 12090-015 | |
| Fenol saturado con buffer | Invitrogen | 15513-039 | |
| Kit GenomiPhi HY | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| Agarosa LMP | Invitrogen | 16520100 | |
| Portaobjetos de microscopio PTFE | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 pocillos, diámetro de 4 mm |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10.000X |
| β-agarasa | New England Biolabs | M0392S |
Referencias
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
