Un método para la cultura de una monocapa de células endoteliales en toda la superficie interior en 3D de un dispositivo de microfluidos con microvascular del tamaño de los canales (<30 micras) se describe. Este In vitro Modelo de microvasculatura permite el estudio de las interacciones biofísicas entre las células sanguíneas, células endoteliales, y factores solubles en enfermedades hematológicas.
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Artículo de método
Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas
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Resumen
Resumen
Los avances en técnicas de microfabricación han permitido la producción de sistemas de microfluidos de bajo costo y reproducible para la realización de experimentos biológicos y bioquímicos en el 1,2 micro y nanoscales. Además, también se han microfluídica se utilizan específicamente para analizar cuantitativamente los procesos hematológicos y microvascular, debido a su capacidad de controlar fácilmente el entorno dinámico fluídico y condiciones biológicas 3-6. Como tal, los investigadores han utilizado más recientemente sistemas de microfluidos para estudiar la deformabilidad de las células sanguíneas, la agregación de células de sangre, el flujo sanguíneo microvascular, y la sangre endoteliales interacciones célula-célula 6-13. Sin embargo, estos sistemas de microfluidos o bien no incluyen células endoteliales cultivadas o eran más grandes que la correspondiente a la sizescale microvasculares procesos patológicos. Una plataforma de microfluidos con cultivos de células endoteliales, que recapitula la precisión celular, físico, y hemodynel medio ambiente amic de la microcirculación que se necesita para avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología subyacente biofísica de enfermedades hematológicas que involucran la microvasculatura.
Aquí se presenta un método para crear una "endotelizado" modelo in vitro de la microvasculatura, utilizando un proceso sencillo, solo la máscara de microfabricación en conjunción con las técnicas de cultivo de células endoteliales, para estudiar las interacciones patológicas microvasculares biofísicos que se producen en la enfermedad hematológica. Este "microvasculatura-en-un-chip" proporciona al investigador un sólido ensayo que se controla estrictamente biológica, así como las condiciones biofísicas y se maneja mediante una bomba de jeringa estándar y claro / microscopía de fluorescencia. Parámetros tales como las condiciones hemodinámicas microcirculación, el tipo de células endoteliales, el tipo de células sanguíneas (s) y la concentración (s), droga / concentración inhibitoria etc, todos pueden ser fácilmente controlado. Como tal, nuestro microsistema ofreceun método para investigar cuantitativamente los procesos de enfermedad en la que se altera el flujo microvascular, debido a alteraciones en la adhesión celular, la agregación y la deformabilidad, la capacidad disponible con los ensayos existentes.
Protocolo
1. La fabricación de la Microdevice endotelial
- Crear una fotomáscara mediante la presentación de un equipo de diseño asistido (CAD) de dibujo del dispositivo de microfluidos a un vendedor de la máscara exterior. La máscara utilizada estaba compuesta de una capa de cromo sobre vidrio de sosa y cal. En este caso la anchura del canal de microfluidos fue de 30 micras.
- Limpiar una oblea de silicio al descubierto con piraña (10:1 relación de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) durante 15 minutos y sumergir en ácido fluorhídrico durante 30 segundos. Enjuague con agua desionizada (DI) de agua durante aproximadamente 10 segundos.
- Usando una....
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Discusión
Nuestro sistema microdispositivo endotelizado es el más adecuado cuando se utiliza en conjunción con los experimentos in vivo, y su enfoque reduccionista puede ayudar a aclarar los mecanismos biofísicos de los procesos hematológicos que se observan en los seres humanos y modelos animales. Además, nuestro sistema no está exento de limitaciones. Por ejemplo, nuestros canales de microfluidos son cuadrados en sección transversal. Aunque técnicamente microcanales circulares se pueden fabricar 10,11,
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a T. Hunt, M. Rosenbluth, y el Laboratorio de Lam por sus consejos y discusiones útiles. Queremos agradecer el apoyo de G. Spinner y el Instituto de Electrónica y Nanotecnología en el Instituto de Tecnología de Georgia. El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por una subvención del NIH K08-HL093360, premio UCSF REAC, un Centro de Desarrollo de Nanomedicina NIH Premio PN2EY018244, y la financiación del Centro para la Biología de las células endoteliales de la Salud de los Niños de Atlanta.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| aguja de punta roma | OK International | 920050-TE | Precisión TE aguja de calibre 20 x 1/2 ", de color rosa |
| dextrano | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| La fibronectina | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Perforador (tornillo de banco pines) | Las innovaciones técnicas | ||
| Las células endoteliales del cordón umbilical (HUVEC) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Elastómero de silicona KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 para desarrolladores | Microchem | Y020100 | |
| Jeringa bomba | Aparato de Harvard | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubo (más grande) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubo, 0.020 "x 0.060" OD |
| tubería (más pequeño) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE tubo microperforado, 0,012 "x 0,030" de diámetro exterior |
Referencias
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J.
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Reimpresiones y permisos
