El método monstruo verde permite el montaje rápido de deleciones múltiples marcados con un gen reportero que codifica la proteína verde fluorescente. Este método se basa en la conducción de las cepas de levadura a través de ciclos repetidos de surtido sexual de las deleciones y de enriquecimiento basado en la fluorescencia de las células que llevan más deleciones.
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Artículo de método
El Proceso de Monstruo Verde para la generación de cepas de levadura que llevan deleciones múltiples genes
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Resumen
Resumen
Fenotipos para un gen de supresión a menudo se revela sólo cuando la mutación se prueba en un fondo genético particular o 1,2 condición ambiental. Hay ejemplos en los que muchos genes deben ser eliminados para desenmascarar funciones ocultas genes 3,4. A pesar del potencial para descubrimientos importantes, las interacciones genéticas que involucran tres o más genes son en gran parte inexplorado. Búsquedas exhaustivas de múltiples interacciones mutantes sería poco práctico debido a la gran cantidad de posibles combinaciones de supresiones. Sin embargo, los estudios de conjuntos seleccionados de genes, como los juegos de paralogs con un mayor priori la posibilidad de compartir una función común, sería informativo.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae, gen knockout se logra mediante la sustitución de un gen con un marcador seleccionable mediante recombinación homóloga. Debido a que el número de marcadores es limitado, se han desarrollado métodos para retirar y volver a utilizar el sam e 5,6,7,8,9,10 marcador. Sin embargo, las mutaciones de ingeniería secuencialmente múltiples utilizando estos métodos lleva mucho tiempo debido a que el tiempo requerido amplía de forma lineal con el número de deleciones que se genera.
A continuación se describe el método de Monstruo Verde para rutinariamente la ingeniería de múltiples eliminaciones en la levadura 11. En este método, una proteína verde fluorescente (GFP) reportero integrado en deleciones se utiliza para las cepas de etiquetas cuantitativamente de acuerdo con el número de deleciones contenidas en cada cepa (Figura 1). Rondas repetidas de surtido de GFP-marcados deleciones a través de apareamiento de levadura y la meiosis junto con citometría de flujo de enriquecimiento de las cepas que llevan más de estas deleciones conducir a la acumulación de deleciones en las cepas (Figura 2). Realización de varios procesos en paralelo, con cada proceso de incorporar una o más supresiones por ronda, reduce el tiempo necesario para la construcción de la cepa. contenido "> El primer paso es preparar un solo haploides mutantes llamado 'ProMonsters', cada uno de los cuales lleva un reportero GFP en un locus eliminado y uno de los 'toolkit' loci, ya sea GMToolkit-un monstruo verde o GMToolkit α-en el . can1Δ locus (Figura 3) utilizando cepas de la colección de supresión de levadura 12, GFP-marcadas deleciones pueden ser convenientemente generado mediante la sustitución de la casete KanMX4 común existente en estas cepas con una GFP universal - URA3 Cada fragmento contiene GMToolkit:. sea la a - o α-apareamiento de tipo específico del marcador de selección haploide 1 y exactamente uno de los dos marcadores que, cuando ambos están presentes GMToolkits, colectivamente permiten la selección de diploides.
El segundo paso consiste en llevar a cabo el ciclo sexual a través del cual loci de deleción se pueden combinar en una sola célula por la variedad aleatoria y / o RECOMB meióticaminación que acompaña a cada ciclo de apareamiento y la esporulación.
Protocolo
1. Generación de ProMonsters
- Preparar el casete GFP reemplazo universal mediante la amplificación de un tetO 2-GFP marcador y el marcador URA3 a partir del plásmido pYOGM012 (resistencia a ampicilina) usando cebadores con secuencias:
GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG y GTACCGGGTAATAACTGATATAAT GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC (regiones en negrita proporcionar homología con las regiones flanqueantes de la casete KanMX4 permite la sustitución específica). La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa Phusion, tampón de HF, y 3% d....
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Resultados
Cuando una cepa haploide a-con cuatro supresiones marcadas GFP-(ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) se cruzó con una cepa haploide-α con cuatro supresiones (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), con dos deleciones (ycl033cΔ yer042wΔ) compartida por dos cepas, un representante resultado se obtuvo. La mezcla de apareamiento se cultivaron en medio YPDA contenía G418 y Nat para seleccionar los diploides. Los diploides resultantes se cultivaron en medio de esporulación. Las espora.......
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Discusión
A medida que desarrollamos el enfoque Monstruo Verde, estábamos preocupados con la posibilidad de recombinación entre diferentes cassettes GFP reemplazo, lo que lleva a la reordenación del genoma. Mitigar contra de esta posibilidad es nuestra selección para las células que han superado con éxito múltiples rondas de apareamiento y la meiosis. Las células que llevan genomas reordenados se espera que sean menos aptos después del apareamiento con las células sin un reordenamiento idénticos. En efecto, no se observó ninguna .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el contrato de EE.UU. Defense Advanced Research Projects Agency N66001-12-C-4039 a YS, una beca de la Fundación Alfred P. Sloan para RSL, y los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 R21 CA130266 HG003224 y fue a FPRFPR también con el apoyo de una beca del Instituto Canadiense para la Investigación Avanzada y por la excelencia Canada Research Chairs programa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo o instrumento | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Disolver en agua y filtrar esterilizar-(0,2-m filtro). Concentración Stock: 200 mg / ml. Almacenar a 4 ° C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER agentes biológicos | 5001000 | Disolver en agua y filtrar esterilizar-(0,2-m filtro). Concentración Stock: 100 mg / ml. Almacenar a 4 ° C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Disolver en etanol al 50% y esterilizar por filtración-(0,2-m filtro). Concentración de stock: 10 mg / ml. Hacer fresco cada cuatro semanas. Escudo de la luz con papel de aluminio y se almacena a 4 ° C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Levadura Difco base nitrogenada w / o aminoácidos | BD | 291940 | |
| Revolver (rotor para tubos) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL unidad de electroforesis | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip para Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria clasificador de células | BD | ||
| MoFlo clasificador de células | Beckman-Coulter | ||
| Biomek robot FX o equivalente | Beckman Coulter | Opcional. Para la creación de informes de terminación de genotipado. |
Referencias
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Scie....
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Reimpresiones y permisos
