La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.
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Artículo de método
La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación
En este artículo
Resumen
Resumen
Microglia son las células del linaje mieloide que residen en el sistema nervioso central (SNC) 1. Estas células juegan un papel importante en patologías de muchas enfermedades asociadas con neuroinflamación tales como la esclerosis múltiple (MS) 2. Microglia en un SNC normales expresan los macrófagos CD11b marcador y exhiben un fenotipo de descanso por los bajos niveles de expresión de marcadores de activación como CD45. Durante los eventos patológicos en el SNC, la microglia se activan según lo determinado por la regulación positiva de CD45 y otros marcadores 3. Los factores que afectan el fenotipo microglia y funciones en el SNC no se ha estudiado bien. Los microARN (miRNA) son una familia creciente de moléculas conservadas (~ 22 nucleótidos de largo) que están involucradas en muchos procesos fisiológicos normales, como el crecimiento y la diferenciación celular 4 y patologías como la inflamación 5. MiRNAs downregulate la expresión de ciertos genes diana por unión secuencias complementarias de laARNm de ir a jugar un papel importante en la activación de las células inmunes, incluyendo los macrófagos y microglia 6 7. Con el fin de investigar las mediadas por miRNA-las vías que definen el fenotipo microglial función biológica, y para distinguir la microglía de otros tipos de macrófagos, es importante para evaluar cuantitativamente la expresión de microARN en particular en distintos subconjuntos de SNC-residente microglia. Los métodos comunes para medir la expresión de miRNAs en el SNC incluyen la PCR cuantitativa a partir de tejido neuronal conjunto y la hibridación in situ. Sin embargo, la PCR cuantitativa a partir de homogeneizado todo el tejido no permite la evaluación de la expresión de miRNA en la microglía, que representan sólo el 15.5% de las células del tejido neuronal. La hibridación in situ permite la evaluación de la expresión de microARN en tipos celulares específicos en las secciones de tejido, pero este método no es completamente cuantitativo. En este informe se describe un análisis cuantitativo y sensitive método para la detección de miRNA por PCR en tiempo real en la microglía aislada de SNC normales o durante la neuroinflamación con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo de ratón para la EM. El método descrito será útil para medir el nivel de expresión de microRNAs en la microglía en el SNC normal o durante la neuroinflamación asociada a diversas patologías como esclerosis múltiple, derrame cerebral, lesión traumática, la enfermedad de Alzheimer y tumores cerebrales.
Protocolo
1. El aislamiento de la microglia del SNC normales
Aislamiento de microglía se realiza como se ha descrito anteriormente con modificaciones 3.
- Preparar los instrumentos para la disección y la perfusión: tijeras, pinzas, jeringa de 10 ml con aguja 27G, 15 ml homogeneizador Dounce (teflón / vidrio), 40 micras de nylon filtro de células, el 40% y 70% de Percoll soluciones, 1X PBS.
- La eutanasia de los ratones por asfixia rápida (privación de oxígeno) en la cámara de CO 2 y de inmediato trasladarlos a mesa de laboratorio para la manipulación quirúrgica y la perfusión.
- Realizar manipulaciones....
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Discusión
Recientemente un gran interés fue dado a la microglía y la participación de estas células en muchas patologías asociadas a la neuroinflamación y la neurodegeneración. Además, el papel de los microRNAs en la diferenciación de las células del sistema inmune y el cáncer ha crecido dramáticamente durante los últimos varios años 5,10. Hemos informado anteriormente el papel de miR-124 en el mantenimiento del fenotipo no activado o en reposo de la microglía en el SNC normal 7, pero el papel de los otros t.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por el NIH R01-01A1 NS071039 beca de investigación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Puede ser preparado a partir de componentes secos en el laboratorio, pH: 7.2-7.4 |
| PBS 10 veces | Thermo Scientific | SH30258.02 | Puede ser preparado a partir de componentes secos en el laboratorio, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965, 10438 | |
| Mirvana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml de 100% de Percoll se prepara mezclando 10 ml de 10X PBS y 90 ml de Percoll de Sigma. 50 ml de 70% de Percoll espreparado por mezcla de 35 ml de 100% de Percoll y 15 ml de DMEM 50 ml de 40% de Percoll se prepara mezclando 20 ml de 100% de Percoll y 30 ml de 1X PBS |
| MOG 35-55 péptido | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| Comité de Libertad Sindical | DIFCO | 263810 | |
| Toxina pertussis | Sigma | P7208 | |
| FcR anticuerpos bloqueantes | BD Biosciences | 553142 | Clon 2.4G2 |
| Anti-CD11b - PE MAB | BD Biosciences | 553311 | Puede ser utilizado con diferentes fluoróforos (por ejemplo, AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs | BioLegend | 103116 | Puede ser utilizado con diferentes fluoróforos (por ejemplo APC) |
| Paraformalformaldehído (16%) | EMS Inc. | 15710 | Diluir 1:15 en PBS 1X |
| 15% de TBE-gel de urea | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| Micro RNA TaqMan transcripción inversa Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| Los ensayos TaqMan mmu microARN miR-124a- | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| Los ensayos TaqMan microARN snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Agua libre de nucleasa | Life Technologies Inc | AM9937 | Agua libre de nucleasa |
| 384 y placa de reacción clara óptica | Life Technologies Inc. | 4309849 | Puede ser sustituido con otras placas (por ejemplo, placa de 96 pocillos) en diferentes instrumentos en tiempo real de PCR |
| Homogeneizador Dounce (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflón / vidrio |
| 40 μ de células colador de nylon | Halcón | 352340 | |
| Centrífuga grande | Sorval | RT 6000B | Diámetro del rotor 18,5 cm |
| Centrífuga pequeña | Eppendorf | 5415 R | Diámetro del rotor 6,5 cm |
| PCR en tiempo real del instrumento | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Puede ser sustituido con otros instrumentos |
| Citómetro de flujo | BD Biosciencess | LSR II | Puede ser sustituido con otros instrumentos |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Puede ser sustituido con otros instrumentos |
| Espectrofotómetro Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Referencias
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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Reimpresiones y permisos
