El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.
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Artículo de método
Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic
En este artículo
Resumen
Resumen
Motilidad celular es un proceso biológico importante para ambos organismos unicelulares y multicelulares. Es esencial para el movimiento de los organismos unicelulares hacia una fuente de nutrientes o fuera de las condiciones inadecuadas, así como en organismos multicelulares para desarrollo de tejidos, la vigilancia inmunológica y la cicatrización de heridas, sólo por mencionar algunos papeles 1,2,3. La desregulación de este proceso puede conducir a graves enfermedades neurológicas, cardiovasculares e inmunológicos, así como la formación exacerbada tumor y diseminarse 4,5. Molecularmente, la polimerización de actina y reciclado del receptor se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la creación de extensiones celulares (lamellipodia), que impulsan el movimiento de avance de la célula 6,7,8. Sin embargo, muchas cuestiones biológicas acerca de la migración de células permanecen sin respuesta.
El papel central de la motilidad celular en la salud humana y la enfermedad pone de relieve la importancia de comprender el mec específicohanisms involucrados en este proceso y hace que los métodos precisos para la evaluación de la motilidad celular particularmente importante. Microscopios se utilizan generalmente para visualizar el movimiento de las células. Sin embargo, las células se mueven más lentamente, por lo que la medición cuantitativa de la migración de células de un proceso consume recursos que requieren costosas cámaras y software para crear cuantitativos Caducada tiempo películas de células móviles. Por lo tanto, la capacidad de realizar una medición cuantitativa de la migración celular que es rentable, no laborioso, y que utiliza el equipo común de laboratorio es una gran necesidad de muchos investigadores.
El ensayo de pista de la motilidad phagokinetic utiliza la capacidad de una célula en movimiento para eliminar partículas de oro de su camino para crear una pista medible sobre un cubreobjetos de vidrio revestida con oro coloidal 9,10. Con el uso de software de libre disposición, múltiples pistas pueden ser evaluadas para cada tratamiento para lograr requisitos estadísticos. El ensayo puede ser utilizado para evaluarmotilidad de muchos tipos de células, tales como células de cáncer de 11,12, fibroblastos, neutrófilos 9 13, células del músculo esquelético, queratinocitos 14 15 16, los trofoblastos, células endoteliales y monocitos 17, 10,18-22. El protocolo implica la creación de diapositivas recubierto con nanopartículas de oro (Au °) que son generados por una reducción de ácido cloroaúrico (Au 3 +) por citrato de sodio. Este método fue desarrollado por Turkevich et al. En 1951 23 y luego mejoró en los años 1970 por Frens et al. 24,25. Como resultado de esta etapa de reducción química, partículas de oro (10-20 nm de diámetro) precipitar a partir de la mezcla de reacción y se puede aplicar a cubreobjetos de vidrio, que son entonces listo para su uso en los análisis de la migración celular 9,26,27.
En general, el ensayo de motilidad phagokinetic track es una medida rápida, fácil y cuantitativa de la motilidad celular. Además, sepuede ser utilizado como un simple ensayo de alto rendimiento, para uso con tipos de células que no son susceptibles de tiempo-caducada formación de imágenes, así como otros usos, dependiendo de las necesidades del investigador. En conjunto, la capacidad para medir cuantitativamente la motilidad celular de múltiples tipos de células sin la necesidad de costosos microscopios y software, junto con el uso de equipo de laboratorio común y los productos químicos, hacer el ensayo de pista de la motilidad phagokinetic una buena elección para los científicos con un interés en comprender celular motilidad.
Protocolo
1. Preparación de gelatina cubreobjetos recubiertos
- Coloque los lavados con ácido cubreobjetos de vidrio (15 mm de diámetro) en un plato de plástico estéril mm 100 (ES). Coloque 8-9 cubreobjetos por placa y asegurarse de que no se toquen entre sí o los lados del plato ..
Nota: cubreobjetos, agujas y pinzas necesitar ser estériles para eliminar posibles microorganismos contaminantes, así como endotoxinas que afectan las funciones celulares, incluyendo la motilidad.
- Pesar el polvo de gelatina y resuspender el polvo en agua desionizada para preparar una solución de gelatina con una con....
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Resultados
Se muestra un ejemplo de las imágenes tomadas con un microscopio óptico que muestra un área de la pista se aclaró por una sola célula (un monocito de nuestros experimentos se muestra en la Figura 2). No móviles células crean característica pequeño óvalo, o en forma de círculo alrededor de sí mismos-tractos que indican un bajo nivel basal de circulación de estas células no estimuladas (figuras 2A y 2B). En contraste, las células muy móviles [en nuestro sistema, el citomegalovirus humano .......
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Discusión
El ensayo de la motilidad phagokinetic pista presentado en este artículo es un método simple y altamente eficaz para el análisis cuantitativo de la migración celular. Debido a múltiples tipos de células pueden ser analizados 9-17, este método tiene el potencial de uso amplio en múltiples disciplinas. El uso de coloidales cubreobjetos de vidrio recubiertas de oro permite la medición de un área de la pista se aclaró por una célula en movimiento. El ensayo puede medir el efecto de diferentes estímulos (es de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (AI050677, HD-051998, y GM103433), Malcolm Feist una beca de investigación cardiovascular, y la American Heart beca predoctoral Asociación (10PRE4200007).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | El número de catálogo | Comentarios |
| Los cubreobjetos de vidrio (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| La gelatina 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Trihidrato ácido tetracloroáurico | Fisher Chemical | G54-1 | 14,5 mM (una solución de trabajo final) |
| Citrato de Sodio | Fisher Scientific | BP327-500 | 0,5% (una solución de trabajo final) |
| Paraformaldehído | Fisher Scientific | O4042 | 3% (una solución de trabajo final) |
| 100 mm placa de cultivo tisular | Sarstedt | 83,1802 | |
| Placas de 12 pocillos | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Placas de 24 pocillos | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Horno Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | El horno de laboratorio estándar será suficiente |
| 10 ml Pipetas serológicas | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler / Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Manual de un canal de pipeta | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Consejos Barrera | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http :/ / rsb.info.nih.gov / ij / | Licencia: Dominio Público | |
| Nikon Eclipse TE300 con un CoolSNAPfx fotométricas monocromo de 12-bit CCD cámara | Nikon | Discontinued; La especificación más comparable tiene Nikon Eclipse Ti, pero un extremo inferior Nikon 80i será adecuado también. Otras marcas también ofrecen microscopios comparables. | |
| Nota: Los reactivos y equipos que figuran a continuación han sido utilizados por nosotros en nuestros diversos estudios. Otros suministros, proveedores, reactivos y equipo puede utilizarse, siempre que tienen especificaciones similares. |
Referencias
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J.
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Reimpresiones y permisos
