Se describen las metodologías para el establecimiento de In vitro Heterotípicas modelos tridimensionales que comprenden fibroblastos de ovario y de superficie ovárica normal o células de cáncer de ovario epiteliales. Se discute el uso de estos modelos para estudiar estromal-epitelial interacciones que se producen durante el desarrollo de cáncer de ovario.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Heterotípicos tridimensional
En este artículo
Resumen
Resumen
Cánceres epiteliales de ovario (EOC) son la principal causa de muerte por neoplasia ginecológica en las sociedades occidentales. A pesar de los avances en los tratamientos quirúrgicos y mejores quimioterapias a base de platino, ha habido pocas mejoras en las tasas de supervivencia COE durante más de cuatro décadas 1,2. Mientras que los tumores en estadio I tienen 5 años las tasas de supervivencia> 85%, las tasas de supervivencia para el estadio III / IV de la enfermedad son <40%. Así, las altas tasas de mortalidad por EOC podría disminuir significativamente si los tumores se detectan en las primeras y más tratables, etapas 3-5. En la actualidad, la base genética molecular y biológica de la enfermedad en etapa temprana de desarrollo se entiende poco. Más específicamente, se sabe poco sobre el papel de la microambiente durante la iniciación del tumor, pero los factores de riesgo conocidos para los EOC (por ejemplo la edad y la paridad) sugieren que el microambiente juega un papel clave en la génesis temprana de EOC. Por lo tanto, desarrollado modelos tridimensionales heterotípicastanto del ovario normal y de las primeras etapas de cáncer de ovario. Para el ovario normal, co-cultivadas superficie epitelial ovárico normal (pierdes) y fibroblastos normales del estroma (INOF) las células, inmortalizada por la transducción retrovrial de la subunidad catalítica de la telomerasa humana holoenzyme (hTERT) para extender la vida útil de estas células en cultivo. Para modelar las primeras etapas de transformación de la célula epitelial de ovario, la sobreexpresión del oncogén cmyc en células Iosé, de nuevo co-cultivadas con células INOF. Estos modelos heterotípicas se utilizaron para investigar los efectos del envejecimiento y la senescencia en la transformación y la invasión de las células epiteliales. Aquí se describen los pasos metodológicos en el desarrollo de estos modelo tridimensional; estas metodologías no son específicos para el desarrollo de ovario normal y tejidos de cáncer de ovario, y podría ser utilizado para estudiar otros tipos de tejido, donde las interacciones de células estromales y epiteliales son un fundamental aspecto del mantenimiento del tejido y dimedad desarrollo.
Protocolo
La Figura 1 ilustra una vista general del flujo de trabajo se describe a continuación.
1. Aislamiento de los fibroblastos normales del ovario y extensión de la vida útil in vitro por la sobreexpresión de la subunidad catalítica de la holoenzima hTERT
- Tejidos ováricos pueden ser recogidos con el consentimiento informado del paciente y la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (para instituciones de Estados Unidos). Los tejidos normales de ovario se puede recoger después de una histerectomía total abdominal o histerectomía laparoscópica total con salpingo-ooforectomía bilateral. En est....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La biología de las primeras etapas del cáncer de ovario epitelial (EOC) es poco conocido. Quizás uno de los impedimentos principales en este campo durante muchos años ha sido la falta de comprensión de los orígenes de tejidos específicos de la enfermedad, y de la importancia del papel del microentorno en el desarrollo de EOC. Durante los últimos años, se ha hecho evidente que EOC es una enfermedad heterogénea con múltiples subtipos distintos histophathological, probablemente con diferentes orígenes celulares para difere.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Esta investigación se realizó en la Escuela Keck de Medicina de la Universidad de California, EE.UU., y la Universidad College de Londres, Reino Unido. KL es financiado por el Instituto Nacional de Salud de subvención U19 5 CA148112-02. BG fue financiado por una subvención para el proyecto de la caridad Apelaciones Eva oncología ginecológica (Reino Unido). Parte de este trabajo realizado en UCLH / UCL fue en parte la financiación del Departamento de Salud NIHR esquema de financiación, el Centro de Investigación Biomédica.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | Proveedor | Número de catálogo | |
| PoliHEMA, adecuado para el cultivo de células | Sigma Aldrich | P3932 | |
| La biología molecular etanol de grado | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Agua estéril para cultivo de células | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medio 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Suero bovino fetal Hyclone | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicina | Sigma Aldrich | G1397 | |
| La anfotericina B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0,25% de tripsina-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Celular colador (40 o 70 micras) | VWR | 21008-949 21008-952 | |
| Anti-anticuerpo de superficie de fibroblastos de proteína, el clon 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-citoqueratina de anticuerpos (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polibreno (bromuro de hexadimetrina) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG telomerasa PCR ELISA PLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Ensayo longitud del telómero | Roche | 12209136001 |
Reactivos Tabla 1. Y el equipo contemplados en este estudio.
Referencias
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
