Summary
Vi beskriver metoder til oprettelse af
Abstract
Epitelial kræft i æggestokkene (EOCs) er den hyppigste dødsårsag fra gynækologisk malignitet i de vestlige samfund. Trods fremskridt inden kirurgiske behandlinger og forbedrede platinbaserede kemoterapier, har der været en lille forbedring i EOC overlevelsesrater i mere end fire årtier 1,2. Mens fase I tumorer har 5-års overlevelsesraterne> 85%, overlevelseschancerne for stadium III / IV sygdom er <40%. Således kunne den høje dødelighed for EOC være signifikant nedsat, hvis tumorer blev opdaget ved tidligere, mere behandlelige, trin 3-5. På nuværende tidspunkt er den molekylære genetiske og biologiske grundlag for sygdommens tidlige stadium udvikling dårligt forstået. Mere specifikt er lidt om den rolle, mikromiljø under tumor initiering, men kendte risikofaktorer for EOCs (fx alder og paritet) tyder på, at mikromiljø spiller en central rolle i den tidlige tilblivelse EOCs. Vi har derfor udviklet tre-dimensionelle heterotypiske modelleraf både normalt ovarie og i early stage ovariecancere. For normalt ovarie, vi co-dyrket normalt ovarialt epitel overflade (IOSE) og normal stromal fibroblast (INOF) celler, immortaliseret ved retrovrial transduktion af den katalytiske underenhed af human telomerase holoenzymet (hTERT) for at forlænge levetiden af disse celler i kultur. At modellere de tidligste stadier af ovarie epitelcelle transformation, overekspression af CMYC onkogenet i IOSE celler, igen dyrket sammen med INOF celler. Disse heterotypiske modeller blev anvendt til at undersøge virkningerne af aldring og alderdom på transformation og invasion af epitelceller. Her beskriver vi de metodiske trin i udviklingen af disse tre-dimensionelle model, og disse metoder er ikke specifikke for udviklingen af normal æggestok og kræft i æggestokkene væv, og kan bruges til at studere andre vævstyper hvor stromale og epitel celleinteraktioner er en fundamental aspekt af vævet vedligeholdelse og diskadedyr eller sygdomme i udvikling.
Protocol
Figur 1 illustrerer en oversigt over arbejdsgangen beskrevet nedenfor.
1. Isolering af normalt ovarialt Fibroblaster og udvidelse af in vitro Levetid ved overekspression af den katalytiske subunit af hTERT holoenzym
- Æggestokkene væv kan indsamles med patientens informerede samtykke og godkendelse af Institutional Review Board (for institutioner i USA). Normale æggestokkene væv kan indsamles efter total abdominal hysterektomi eller total laparoskopisk hysterektomi med bilateral salpingo-ooforektomi. I denne undersøgelse blev vævene undersøgt af en patolog og en del af ovarie stroma biopsi til celledyrkning. Vævsprøver på ca 2-5 mm 2 blev høstet fra det centrale område i æggestokkene at forsøge at reducere chancen for også prøveudtagning ovarie epitel.
- Transportere frisk ovarievæv til cellekulturen laboratorium i immortaliserede normalt ovarialt fibroblast (INAF) vækstmedium suppleret med ekstra antibiotika og antimykotika. INOF vækstmedium (INOF-GM) omfatter: Mellem 199 og MCDB105 blandes i forholdet 1:1, suppleret med 15% kalvefosterserum, 2 mM L-glutamin, 50 gg / ml gentamicin og 250 ng / ml amphotericin B.
- Arbejde inden i en biosikkerhed kabinet: Fjern alle epitelceller, der forbliver løst bundet til vævet, ved vask af prøven med 5 ml PBS. Aspirer og gentag to gange mere.
- Overfør prøven plus PBS i en ren diameter på 10 cm (P100) dyrkningsskål. Anvend steril pincet til at håndtere vævet og anbringes i en anden, tør P100 ren dyrkningsskål. Anvend sterilt skalpel til at skære væv 0,5 cm 2 stk. Placer hvert stykke væv i en separat P100 skål og yderligere skåret i stykker <1 mm 2 i størrelse. Tilsættes 20 ml INOF-GM (plus antibiotika og antimykotika), og der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Overvåge cellevækst ved hjælp af fase mikroskopi. Celler kan ses klæber til skålen wit hin 24 timer.
- Re-foder efter en uge,. Fjerne eventuelle ikke-vedhængende væv ved sugning Derefter refeed kulturer to gange om ugen. Celler vil danne kolonier, sædvanligvis inden for 1-3 uger. Når disse kolonier er store nok til subkultur (når de når ca 500 um), isolere kloner under anvendelse af trypsin-coatede kloning diske.
Bekræfte celler er 100% fibroblastisk og fri for andre cellulære kontaminanter ved at udplade en prøve af cellelinien på dækglas og udføre immuno-fluorescerende farvning for en fibroblastisk markør (FSP), en epithelial markør (pan-cytokeratin) og et endotelcelle markør (von Willenbrand faktor VIII). - Passage primære normalt ovarialt fibroblast (NOF) celle-isolater fra en enkelt P100 skål i 3 P100 retter en dag før retroviral transduktion af hTERT. Pre-made virale supernatanter kan købes eller er fremstillet in-house anvendelse af standard protokoller for co-transfektion HEK293T celler (setarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retrovirale supernatanter kan fremstilles ved anvendelse af pBABE-hygro-hTERT-vektoren (Addgene). Fjern NOFs fra inkubatoren og derefter aspireres cellekulturmediet. Tilsæt 3 ml viral supernatant til hver skål: en skål modtager hTERT-retrovirus, det 2. skålen modtager GFP-retrovirus og den tredje skålen modtager uden virus. Overlay virale supernatanter med INOF-GM indeholdende polybren til opnåelse af en slutkoncentration på 8 ug / ml. Re-feed-celler den følgende dag med frisk medium. To dage efter infektion, begynder valget med lav dosis (10 U / ml) hygromycin B. Efter syv dage i denne dosis kan øges til 20 U / ml; udvælgelsen bør være afsluttet inden for 10-14 dage. - Kloner, der udtrykker hTERT eller GFP kan isoleres ved ring kloning når de når omkring 500 um. Cellelinier kræver yderligere karakterisering for at bekræfte vellykket ekspression af hTERT og fastholdelse af primære cellelinie egenskaber. Dette indebærer: (a)bekræfte telomeraseaktivitet ved PCR-ELISA og telomer længde, ved Southern blot eller PCR 6,7 (b) bekræftelse af ekspressionen af kritiske markører (f.eks immunofarvning med et anti-pan-cytokeratin-antistof til at identificere epitelceller, og med et anti- fibroblast overfladeprotein antistof for fibroblaster) er ens for primær-og hTERT-immortaliserede celler, (c) bekræfte at cellerne ikke viser egenskaber af neoplastisk transformation (fx ved hjælp af forankringsuafhængig vækst-assays), (d) bekræfter forlængelse af in vitro levetid observeret i . celler, der udtrykker hTERT men ikke GFP hTERT-udtrykkende udødeliggjorte normale ovariale fibroblaster (INOFs) bør bypass replikativ senescens, men ikke neoplastisk transformerede, endvidere de INOF celler bør opretholde ekspressionen af fibroblast overfladeprotein men ikke epitel-markører, såsom cytokeratin (figur 2) .
2. Coating af væv Culture Retter med polyHEMA for Non-klæbende Cell Culture
- For at forberede polyHEMA løsning afvejes 1,5 g polyHEMA, og anbringes i en steril flaske. Tilsættes 95 ml molekylærbiologisk kvalitet absolut ethanol og 5 ml cellekultur kvalitet destilleret vand. The polyHEMA-hydrogel vil opløses i vandet i opløsningen, og ethanolen vil sterilisere præparatet.
- Placer polyHEMA opløsningen i et vandbad ved 65 ° C indtil fuldstændig opløsning. Dette kan tage op til 8 timer. Bemærk, at polyHEMA løsning ikke kan opbevares i længere tid, og så bør altid være forberedt friske.
FEJLFINDING: Opløsninger af polyHEMA kræver lange inkuberingstider ved 65 ° C. Regelmæssigt vende polyHEMA løsning at blande. Viskositet observeret ved bunden af glasflaske angiver polyHEMA er ikke fuldstændigt opløst og yderligere inkubation ved 65 ° C er påkrævet. - Arbejde inden i en laminar strømningshætte, coat vævskulturskåle med polyHEMA opløsning. Enhver Size af vævsdyrkningsskål, kolbe eller flerbrøndsplade kan overtrækkes med polyHEMA. Anbefalede volumener af polyHEMA opløsning kræves for hvert fartøj er angivet i tabel 2.
- Tillad celle dyrkningsskåle at tørre inden i laminar strøm-hætte. Dette kan tage 2-3 dage. Let rocking på en vippende platform kan anvendes til at sikre jævn belægning af større størrelse retter eller-kolber. Hvis de polyHEMA opløsning tørrer for hurtigt overfladen muligvis ikke glatte. For at undgå dette, at låget af skålen / kolben forbliver tændt under hele tørreprocessen.
- Påfør endnu et lag af polyHEMA og lad dem tørre som beskrevet ovenfor.
FEJLFINDING: Huller i polyHEMA belægning kan forekomme, især når pladerne tørre for hurtigt. Dobbelt-coating af pladerne med polyHEMA bidrager til at udfylde huller eller revner i overtrækket er dækket før anvendelse. Plader normalt tager 2-3 dage for hver polyHEMA frakke at tørre, og så bør udarbejdes mindst en uge, før de vil være behov for cellekultur. - PolyHEMA-belagte plader kan opbevares ved stuetemperatur indtil anvendelse.
BEMÆRK: 1% agarose opløsninger, opløst i 1X PBS og autoklaveret for at sterilisere, kan også anvendes til overtrækning af cellekultur-skåle for at skabe en ikke-klæbende overflade til kortvarig 3D dyrkning (mindre end en uge). Agarose coating af multi-brønds plader skaber en konkav overflade, som fremmer dannelsen af en enkelt sfæroide pr godt for mange cellelinier. Men for længere 3D kulturer polyHEMA belægning anbefales som agarose belægning ofte opløses efter længere kultur perioder.
3. Generering af tredimensionale (3D) heterotypisk Sfæroider og Re-fodring af 3D-kulturer
- Genoprette og udvide INOF og epithelial in vitro-cellekulturer at forberede nok celler til etablering af 3D heterotypiske sfæroider. For 'massekulturer "vi typisk frø 2-4x10 6 INOFs pr P100 skål og 0,5-1x10 6 epitelceller at give en stromale: epitel ratio på 4:1. INOF celler dyrkes i INOF vækstmedium (INOF-GM) uden gentamicin eller amphotericin B. Om ønsket kan fibroblastceller forbehandles før 3D-kultur (fx til induktion af degeneration kan celler behandlet med subletale doser af hydrogenperoxid ).
- Vask et tørt polyHEMA plade med 5 ml phosphatpufret saltvand (PBS) i 5 minutter. Aspirer PBS og erstat med 15 ml INOF-GM.
- I mellemtiden Trypsinisér udødeliggjorte normale ovariale fibroblastceller at frigøre dem fra dyrkningsskålen, efter 3-5 min neutralisere trypsin med et lige volumen af dyrkningsmedium og pelletere cellerne ved centrifugering ved 450 x g i 5 min.
- Supernatanten kasseres. Opret en enkelt-cellesuspension ved at resuspendere cellepelleten i 5 ml INOF-GM, bland godt ved pipettering op og ned eller vortexbehandling forsigtigt. Bestem cellekoncentrationen ved at blande 10 pi cellesuspension og 10 pi trypanblåt og optælling anvendelse af et hæmocytometer. Trypan blå eksklusion kan bruged at identificere levende celler.
- Tilføj 4x10 6 INOF celler til mediet allerede dispenseret i polyHEMA-overtrukne plade. I kultur-medierne volumen til 20 ml under anvendelse af et passende volumen af frisk INOF-GM og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Celler begynder at aggregere til multicellulære sfæroider inden for 24 timer. Sfæroid formation kan overvåges ved fasemikroskopi.
Nøjagtig optælling af sfæroide numre under masse dyrkningsbetingelser er svært, men vi vurderer, at vi får 50-100 sfæroider når 4x10 6 stromaceller udplades. Sfæroid størrelser typisk i området fra 80 til 250 um. - Indføres mere end de sfæroide kulturer hver 2-3 dage ved at hvile pladerne i en vinkel på en pipette anbragt inden i laminar strøm-hætte. Lad sfæroiderne at bosætte sig. Dette kan tage op til 20 min. Fjern forsigtigt de udmattede medier med en 5 ml pipette, indtil kun cirka 4 ml forbliver i skålen. Pas på ikke at aspirere sfæroiderne. Re-feed med 16 ml frisk INOF-GM og vende tilbage til inkubatoren.
- På dag 7, tilsættes epitelceller til fibroblast sfæroider at skabe heterotypiske kulturer som følger. Forbered suspensioner af æggestokkene epitelceller (fænotypisk normal eller transformeret) ved trypsinisering som beskrevet i afsnit 3,4-3,5. Bestemme cellekoncentration anvendelse af et hæmocytometer. Vask en gang i INOF-GM for at forhindre eventuelle vækstfaktorer fra at blive overført fra de epiteliale vækstmedier.
I vort laboratorium, epitelceller (OSEC) linier normalt ovarialt overflade blev opsamlet med patientens informerede samtykke fra ovarier fjernet ved total abdominal hysterektomi eller total laparoskopisk hysterektomi med bilateral salpingo-oophorektomi. Ovarier blev børstet med en steril cytobrush at indsamle epithelet. Primære cellelinjer blev etableret og transduceres med hTERT anvender metoden beskrevet ovenfor. Nærmere oplysninger om OSEC kultur i 2D, kan 3D og OSEC immortalisering findes i referencerne 10 og 11. - Til dannelse af heterotypisk spheroids, første re-feed kulturer af fibroblast sfæroider alene. Derefter inokulere fibroblast sfæroide kulturer med 1x10 6 epitelceller i et forhold på 04:01 fibroblaster til epitelceller. Kultur de heterotypiske sfæroider i INOF-GM.
- Re-feed heterotypiske kulturer hver 2-3 dage for yderligere 14 dage.
4. Behandling for Imaging and Molecular Analyser
- Mange forskellige teknikker kan anvendes til at analysere heterotypiske sfæroider. Til billeddannelse, anbefales det, at sfæroider høstes fra dyrkningsskålen med en 25 ml pipette. Pipettering langsomt vil minimere risikoen for forskydningskræfter forstyrrer arkitektur klumpformet. Sfæroider kan derefter vasket i PBS og pelleteret ved forsigtigt centrifugering ved 100 x g i 10 minutter, højere centrifugalkræfter kan beskadige sfæroiderne. Alternativt kan kulturerne overført til et 50 ml Falcon-rør og fik lov at henstå, og vækstmediet derefter fjernet.
- For immunohistokemiskkemi, fastsætter sfæroider med neutral bufret formalin i 30 minutter ved stuetemperatur. Pellet sfæroiderne og erstatte formalin med 70% ethanol. Proces i paraffin anvendelse af standard protokoller, der anvendes for humane væv. Paraffinindlejrede sfæroider kan være snittet og farvet med enten hematoxylin og eosin eller specifikke molekylære markører ved hjælp af standard immunhistokemi (figur 3).
- Alternativt kan sfæroider vasket i PBS blive fikseret i 4% paraformaldehyd (fremstillet i PBS), indlejret i Optimal Cutting Temperatur oktober medium og lynfrosset for frosne sektionering og immunfluorescensfarvning.
- Til molekylære analyser, kan sfæroiderne høstes, pelleteret og vasket to gange i PBS før lysering af celler for DNA, RNA eller proteinekstraktion.
- Til analyse ved flowcytometri, kan sfæroider vaskes i PBS og dissocieret med trypsin eller accutase fordøjelse ved 37 ° C. For at gøre dette, nedsænkes Falcon rør indeholdende sfæroider ina vandbad for at lette trypsinisering. Fuldstændig dissociation af sfæroider i en enkelt cellesuspension kan fremmes ved pipettering af opløsningen op og ned med en 1 ml pipettespids. Pas på ikke at over-Trypsinisér cellerne.
Reaktionsblandingen neutraliseres med et tilsvarende volumen af dyrkningsmedium og fjern celleklumper ved at passere suspensionen gennem et 40 til 70 um cell strainer. Pellet-celler, vask med PBS, optælle og resuspender det ønskede antal celler i FACS-puffer. Stain celler ifølge producentens instruktioner.
5. Repræsentative resultater
Denne fremgangsmåde kan anvendes til en lang række applikationer, og til undersøgelse af normalt ovarialt biologi samt undersøgelsen af ovariecancer indledning. En stor fordel ved denne fremgangsmåde frem 3D kulturer oprettes ved anvendelse af kommercielt tilgængelige ekstracellulære matrix gel er, at de normale ovariale fibroblaster producerer den ekstracellulære matrix, der gør uP kernen i de sfæroider. Det er vores erfaring, er matrixmaterialet produceres af normale æggestokkene fibroblaster heterogen og mere ligner den ekstracellulære matrix i æggestokkene end nogen kommercielt tilgængelig matrixgel. I vores laboratorium har vi anvendt epitelceller, der er delvis transformeret in vitro under anvendelse definerede genetiske elementer (f.eks CMYC overekspression) og co-dyrkede disse celler med normale og aldrende æggestokkene fibroblaster til at efterligne den tidlige fase ovariecancer i en postmenopausal æggestok. Vore data antyder, at den aldrende mikromiljø fremmer neoplastiske karakteristika (fx proliferation) af delvist transformerede epitelceller (figur 3), medens en normal mikromiljø inhiberer neoplastisk progression 8. Vores lab og andre har også brugt lignende metoder til at modellere normale æggestokke epitelceller 9, æggeleder epitelceller, trinvise modeller for neoplastisk progression
Figur 1. Skematisk oversigt over protokollen for 3D heterotypisk dyrkning. Vævskulturkolber er to gange belagt med en 1% polyHEMA opløsning og fik lov at tørre. PolyHEMA overtrukne plast vaskes med 1 x PBS umiddelbart før brug. Udødeliggjorte normale ovariale fibroblastceller (4x10 6 celler) udplades i kolben med 20 ml vækstmedium. Sfæroid dannelse og vækst overvåges over 7 dage. På dette tidspunkt, er fibroblast-sfæroide kulturer podet med 1x10 6 epitelceller, og de to celletyper dyrkes sammen i 14 dage, før de multicellulære sfæroider høstes og behandles til efterfølgende anvendelser (molekylære analyser, billeddannelse osv.).
Figur 2. Immunfluorescensfarvning af hTERT </ Em> udødeliggjort normale æggestokkene fibroblaster. Både primære normale æggestokkene fibroblaster (Pr NOFs) og udødeliggjorte normale æggestokkene fibroblaster (INOFs) udtrykkelig fibroblast specifikt protein (FSP), er ikke udtryk for cytokeratin-7 (Ck-7) og udtrykke vimentin (VIM) . Markører af interesse er vist med grønt, er DNA farvet med DAPI og vist i blåt, er cytoplasma modfarvet med Evan blå og vist i rødt.
Figur 3. Immunhistokemi af co-dyrkede stromaceller og epitelceller. Venstre panel, normalt ovarialt fibroblast klumpformet monokultur, farvet med hematoxylin og eosin. Normalt ovarialt fibroblastceller dyrket alene i 3D dannelse af sfæroider, der består af celler med et spindled-morfologi og rigelig ekstracellulær matrix. Højre panel: normale ovariale fibroblaster blev udsat for hydrogenperoxid til fremkaldelse af senescens. Delvist transformerede æggestokkene epitelceller (IOSE
Figur 4. Histologiske funktioner i 3D dyrkede celler afspejler primære væv. (A) Klare celle ovariecarcinomer viser karakteristiske klare cellestrukturer, disse er fraværende, når klare celle EOC-linier dyrkes på plast, men lignende strukturer bliver opdaget ved de samme celler dyrkes som 3D sfæroider ( B). (C) scanningselektronmikrografi af normalt ovarialt epitelceller dyrket som sfæroider i 14 dage. Overflade mikrovilli er synlige (pile). (D) Serøse ovariecancer cellelinje sfæroider, i kultur. (A, B) hematoxylin og eosin-farvning af snit paraffinindlejret tumorvæv eller 3D sfæroider, (C) scanningelektronmikroskopi (d) fasekontrastmikroskopi. Sfæroider kan være sfæriske (stiplede cirkel)eller uregelmæssig form, som i tilfældet med strukturen vist i venstre side af billedet.
| Fad / Plate Size | Volumen af polyHEMA (der skal anvendes to gange) | Culture Media Final Volume |
| 6-brønds plade | 3 ml | 5-7 ml |
| Plade med 12 brønde | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-brønds plade | 500 pi | 1,5 ml |
| 48-brønds plade | 250 ul | 500 pi |
| Plade med 96 brønde | 50 pi | 200 pi |
| P100 dyrkningsskål | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 dyrkningsskål | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25-kolbe | 2-3 ml | 7 ml |
| F75-kolbe | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 kolbe | 15 ml | 30-50 ml |
Tabel 2. Anbefalede mængder for polyHEMA belægning og 3D-dyrkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biologi tidlige fase epitelial kræft i æggestokkene (EOC) er svær at forstå. Måske en af de væsentligste hindringer på dette område i mange år har været den manglende forståelse af vævsspecifikke oprindelse af sygdommen, og om betydningen af den rolle, mikromiljøet i EOC udvikling. I de senere år er der blevet klart, at EOC er en heterogen sygdom med flere distinkte histophathological subtyper, formentlig med forskellige cellulære oprindelse til forskellige undertyper. For eksempel viser de aktuelle data, high-grade serøse EOCs kan stamme fra både æggeleder sekretoriske epitelceller og ovarie overflade epitelceller, i det mindste en del af endometrioid og klar celle EOCs menes at hidrøre fra ovarie endometriosis (endometrioma), og mucinous EOCs kan skyldes paraovarian eller paratubal overgangsperiode-type epitel 15,16. Imidlertid har der kun været begrænset in vitro og <em> in vivo modeller for sygdomsprogression for nogen af disse histotypes. In vitro heterotypisk modellering af EOC at studere tumor stroma-epiteliale interaktioner og mikromiljøet forbundet med udviklingslande ovariecarcinomer er en endnu mindre udviklet forskningsområde. Den tumorstroma er sandsynligvis både en kilde til tumor biomarkører samt en hidtil ukendt mål for terapi. Udviklingen og anvendelsen af heterotypiske modeller af EOC kan derfor være nøglen til at identificere nye biomarkører i forbindelse med sygdommens tidlige stadium, der kan anvendes som en del af et program for screening og tidlig påvisning af sygdommen, eller til identifikation af nye, druggable terapeutiske mål at forbedre behandlingsregimer for patienter diagnosticeret med EOC.
Mere grundlæggende kunne de modeller vi har beskrevet anvendes til at få en dybere forståelse af de underliggende fænotypiske og molekylære forandringer, der sker i løbet af EOC initiering og tidlig udvikling af sygdom. Det er nu klart, at forskellige EOC undertyper har distinkte molekylære profiler, kliniske karakteristika og underliggende biologi. Ved at generere et bibliotek af EOC precursorceller og modellering af udviklingen af hver kræft subtype, herunder de microenvironmental påvirkninger, kan det være muligt at få nye indsigter i udviklingen af EOC histotypes gennem modeller, som præcist afspejler sygdom udvikling i den menneskelige tilstand. De metoder, vi beskriver, kan anvendes til en lang række undersøgelser og applikationer, herunder undersøgelser af andre faste tumorer. Vi har testet kugleformet dannelse evne i over halvtreds forskellige normale og transformerede ovariale cellelinier til dato, og observeret, at langt de fleste cellelinier er i stand til dannelse af sfæroider, når udpladet ved høje celledensiteter på polyHEMA-coatede plader. Vi forventer derfor, at cellekulturmodeller fra andre mammale organer og også andre arter kan også dyrkes i 3D hjælp af denne fremgangsmåde.
ve_content "> Disse fremgangsmåder kan repræsentere et fremskridt specielt til undersøgelser af betydningen af mikromiljøet under tumorinitiering, for eksempel i undersøgelser af vekselvirkninger af diskrete somatiske genetiske afvigelser i tumor epitelceller eksisterende samtidig med specifikke microenvironmental variabler. Vi har vist, at fænotypiske ændringer i stromale celler kan påvirke epitelcelle fænotype 8. Ved ændring af celle-typer i modellen, kan man undersøge, om forskellige stromaceller differentielt påvirker epitelcelleproliferation og også ekspression af andre specifikke markører fx markører forbundet med invasion og metastase. Desuden er disse modeller kan også anvendes i studiet af godartede sygdomme og normalt ovarialt fysiologi. For eksempel kan sådanne 3D modeller anvendes fertilitetsstudier at evaluere rollen af ovarie stroma under oocytmodning.For at studere bidraget af microenvironment til EOC udvikling og den rolle af ovariecancer-associerede fibroblaster i maligne EOCs, kan disse modeller også tilpasses ved co-dyrkning ovariecancerceller med fibroblaster isoleret fra tumorprøver. Mere komplekse kulturer kan også frembringes ved at indføre yderligere, relevante celletyper i heterotypisk struktur. Eksempelvis kan modellen af stromale og epiteliale celleinteraktioner vi udviklet suppleret med indførelsen af granulosaceller, immune eller endotelceller. En anden mulighed ville være at co-kultur andre precursor celletyper i æggestokkene stroma model, såsom epitelceller fra æggelederen og endometrium. Det er også muligt at modellere yderligere parakrine interaktioner, der er foreslået til at være vigtigt i EOC indvielse. For eksempel kunne steroidhormoner indføres i heterotypisk model eller ekspression af parakrine handler gener kunne blive foruroliget udelukkende i det stromale rum ogvirkningen på epitelceller målt.
Størstedelen af ovariecancer er identificeret på et sent tidspunkt, efter at sygdommen er udbredt bredt i hele bughinden. Ovariecancer diagnosticeret, når lokaliseret til ovarierne (trin 1) effektivt kan behandles med kirurgi, og i over 90% af tilfældene patienterne helbredt for deres sygdom. Det er klart, at strategier for tidligere påvisning af ovariecancer væsentligt kunne reducere kræft i æggestokkene sygelighed og dødelighed. Ved at få en dybere forståelse af det tidlige sygdomsstadium udvikling ved hjælp organotypiske modellering såsom dem beskrevet her, forventes det, at nye muligheder for påvisning af sygdommen i udsatte befolkningsgrupper vil blive afsløret og i sidste ende omsættes til klinisk praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne forskning blev udført på Keck School of Medicine, University of California, USA og University College London, UK. KL er finansieret af National Institute of Health tilskud 5 U19 CA148112-02. BG blev finansieret af en projektbevilling fra Eve Appeal gynækologiske onkologiske velgørenhed (UK). Noget af dette arbejde, der udføres på UCLH / UCL blev delvist tilskud fra Department of Health er NIHR Biomedical Research Centre støtteordning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
