Heterotípicos tridimensional In Vitro Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

El objetivo general del siguiente experimento es generar modelos típicos tridimensionales del desarrollo del cáncer de ovario en etapa temprana. En primer lugar, generar líneas celulares inmortalizadas de H turt derivadas de tejidos epiteliales ováricos y fibroblastos primarios y normales. A continuación, para recrear la arquitectura in vivo y las complejas interacciones celulares presentes en el cocultivo de ovario, las líneas celulares epiteliales y estromales en modelos tridimensionales de esferoides S proceden a fijar y teñir los cultivos de organoides y a analizar la expresión de marcadores específicos con el fin de estudiar las características moleculares de las interacciones epiteliales estromales.

Los resultados obtenidos muestran cómo las alteraciones en el compartimento de las células estromales de los modelos típicos 3D pueden influir en el fenotipo de las células epiteliales cocultivadas. Los modelos típicos tridimensionales pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer de ovario, como explorar los orígenes de esta enfermedad y dilucidar el papel del microambiente estromal en la iniciación y el desarrollo de tumores. Las aplicaciones de estas técnicas se extienden hacia el diagnóstico y la terapia de enfermedades en comparación con otros métodos de cultivo en 3D.

Esta técnica se puede aplicar a una gama más amplia de volúmenes de cultivo celular y aplicaciones posteriores. Por ejemplo, los cultivos homo y típicos en 3D se pueden utilizar para las pruebas de drogas in vitro. Este enfoque también se puede aplicar a otros sistemas modelo, como en el estudio de otros tipos de tumores sólidos o en enfermedades benignas.

Transportar el tejido ovárico fresco al laboratorio de cultivo celular en un medio de crecimiento de fibroblastos ováricos normales inmortalizado complementado con antibióticos y payasadas adicionales. Lave la muestra tres veces con cinco mililitros de PBS para eliminar las células epiteliales que permanezcan poco adheridas al tejido. A continuación, transfiera la muestra más PBS a una placa de cultivo P 100 limpia Utilizando instrumentos estériles, transfiera el tejido a una segunda placa de cultivo limpia P 100 seca.

Corta el pañuelo en trozos de 0,5 centímetros cuadrados y transfiere cada trozo a un plato P 100 por separado. Continúe cortando el pañuelo en pedazos de menos de un milímetro cuadrado de tamaño. A continuación, añada 20 mililitros de medios INOF GM y controle el crecimiento celular mediante microscopía de fase.

Confirme que las células se adhieren a la placa dentro de las 24 horas. Monitorizar el crecimiento celular mediante microscopía de fase Las células suelen adherirse a la placa en un plazo de 24 horas después de una semana. Eliminar cualquier tejido no adherente por aspiración, reponer el medio y, a partir de entonces, realimentar los cultivos dos veces por semana en un plazo de una a tres semanas cuando las colonias celulares tengan un tamaño de aproximadamente 500 micras.

Aísle los clones mediante trips y discos de clonación recubiertos. Con el fin de confirmar el 100% de células fibroblásticas. Coloque una muestra de la línea celular en cubreobjetos de vidrio y realice una tinción inmunofluorescente para un marcador fibroblástico, un marcador epitelial y un marcador de células endoteliales.

Un día antes de la transducción retroviral del paso de H Turt, la célula de fibroblastos ováricos normales se aísla de una sola placa P 100 en tres placas P 100. El suministro viral prefabricado se puede comprar o producir internamente utilizando protocolos estándar para la transfección de cuna de células T HEC 2 9 3. Para preparar la solución de poly hema, pese 1,5 gramos de poly hema y colóquela en un frasco estéril.

Agregue 95 mililitros de etanol absoluto de biología molecular y cinco mililitros de agua destilada de grado de cultivo celular. Coloque la solución de poly Hema en un baño de agua a 65 grados centígrados hasta que se disuelva por completo. Cubra las placas de cultivo de tejidos con una solución de poly Hema recién hecha.

Seque al aire las placas de cultivo celular dentro de la campana de flujo laminar. Se puede utilizar un balanceo suave en una plataforma oscilante para asegurar un recubrimiento uniforme de platos o matraces de mayor tamaño. Si la solución de polyus se seca demasiado rápido, la superficie no será lisa.

Si lo desea, pretrate los fibroblastos antes del cultivo 3D, por ejemplo, para la inducción de la senescencia, pretrate las células con dosis subletales de peróxido de hidrógeno. Recuperar y expandir el INOF y los cultivos de células epiteliales in vitro para preparar suficientes células para establecer esteroides heterotópicos en 3D. Después de un lavado de PBS de cinco minutos, agregue 15 mililitros de medio a la placa de poliéster hema.

Mientras tanto, agregue tripsina a las células de fibroblastos ováricos normales inmortalizadas para separarlas de la placa de cultivo. Después de tres a cinco minutos, neutralice la tripsina con un volumen igual de medios de cultivo y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet de celda en un medio de cinco mililitros y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo o agitando suavemente en vórtice.

A continuación, utilice una muestra de 10 microlitros para enumerar las células viables utilizando el azul de triano. Ahora agregue 4 millones de células INOF al medio ya dispensado en la placa recubierta de poly hema. Aumentar el volumen del medio de cultivo a 20 mililitros e incubar a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono.

Monitorizar la agregación celular en esteroides multicelulares mediante microscopía de fase para realimentar los cultivos de esferoides S cada dos o tres días. Coloque las placas en ángulo sobre una pipeta. Deje que los esferoides se asienten y retire con cuidado unos 16 mililitros de los medios agotados con una pipeta de cinco mililitros.

Agregue 16 mililitros de medio fresco al cultivo y regrese a la incubadora el día siete. Cree cultivos heterotípicos mediante la adición de células epiteliales a los fibroblastos phe. En primer lugar, prepare suspensiones de células epiteliales ováricas por tripsina como se describió anteriormente después de enumerar las células.

Lavar una vez en el medio INOF GM para evitar que los factores de crecimiento se transfieran del medio de crecimiento epitelial. Después de reponer el medio de los cultivos de OID de fibroblastos, agregue las células epiteliales en una proporción de cuatro a un cultivo de fibroblastos por células epiteliales. Los OID heterotópicos en INOF GM realimentan los cultivos típicos cada dos o tres días durante 14 días adicionales.

Para la inmunohistoquímica, fije la PHE con formina neutra tamponada, granule la PHE y reemplace la formalina con etanol al 70%. Proceda a procesar en parafina utilizando los protocolos estándar utilizados para los tejidos humanos. Los esteroides incluidos en parafina se pueden seccionar y teñir con h y e de marcadores moleculares específicos mediante química inmunohística.

Alternativamente, lave los esteroides en PBS y fíjelos en 4% para formaldehído. A continuación, incruste las muestras en medio OCT y congele a presión para el corte de criostato y la tinción inmunofluorescente para su análisis por citometría de flujo. Lavar los esteroides en PBS y disociar por digestión con tripsina o Accutane a 37 grados centígrados.

La disociación completa de los esteroides en una suspensión de una sola célula se puede promover pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de un mililitro. Tenga cuidado de no sobredimensionar las células, neutralice la reacción con un volumen igual de medio de cultivo y elimine los grumos de células pasando la suspensión a través de un filtro de células de 40 a 70 micras. Luego, granule las células y lávelas con PBS y enumere, vuelva a suspender el número deseado de células en hechos, tampón y tinte de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En nuestro laboratorio, hemos transformado parcialmente células epiteliales ováricas y hemos cocultivado estas células con fibroblastos ováricos normales y senescentes para imitar el desarrollo del cáncer de ovario en etapa temprana.

En un ovario premenopáusico, la tinción inmunofluorescente de los fibroblastos ováricos normales inmortalizados muestra que tanto los fibroblastos ováricos normales primarios como los fibroblastos ováricos normales inmortalizados expresan la proteína específica del fibroblasto, pero no expresan citoqueratina siete y expresan mentón. Las células normales de fibroblastos ováricos cultivadas solas en forma 3D PHE muestran una morfología fusiforme y una abundante matriz extracelular. Aquí, los fibroblastos ováricos normales se expusieron a peróxido de hidrógeno para inducir la senescencia durante siete días y luego se cultivaron con células epiteliales ováricas parcialmente transformadas durante 14 días.

Para distinguir los dos tipos de células, los esteroides resultantes se tiñeron inmunológicamente para mim one como marcador de proliferación y pancitoqueratina como marcador epitelial. La cuantificación de los datos sugiere que el microambiente envejecido promueve características neoplásicas de células epiteliales parcialmente transformadas, mientras que un microambiente normal inhibe la progresión neoplásica, características histológicas de células normales y malignas que no son detectables cuando las células se cultivan a medida que se restauran las monocapas. Cuando las células se transfieren al cultivo de esferoides, por ejemplo, las características histológicas de los cánceres de ovario de células claras se pueden detectar en cultivos 3D de líneas celulares de cáncer de ovario de células claras, pero no en cultivos de una sola capa de las mismas células.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar cultivos típicos tridimensionales con los que estudiar las interacciones entre las células epiteliales y estromalas. Durante la génesis temprana del tumor. Al configurar un cultivo 3D, es importante ajustar el número de celdas de acuerdo con la aplicación posterior, lo que permite cierta pérdida de material durante el procesamiento.

Una vez dominados, los cultivos 3D se pueden configurar en una hora siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo combinada con la generación de perfiles de microrrayos de expresión génica, para analizar los cambios globales en la expresión génica que se producen en cultivos típicos 3D pero que no se detectan en condiciones de cultivo monocapa. Esto permitirá la disección de las vías de señalización bidireccional que se producen específicamente bajo un cultivo central 3D. Microambiente.