De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Summary

Los métodos para desarrollar y validar un ensayo cuantitativo de fluorescencia para medir la actividad de potasio rectificador de entrada (Kir) canales para la investigación de compuestos de alto rendimiento se presenta.

Abstract

Miembros específicos de la familia rectificador de potasio hacia el interior del canal (Kir) se postulan dianas de fármacos para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, fibrilación auricular, y ^1,2 dolor. En su mayor parte, sin embargo, el progreso hacia la comprensión de su potencial terapéutico o funciones fisiológicas incluso básicos ha sido retrasado por la falta de buenos herramientas farmacológicas. En efecto, la farmacología molecular de la familia rectificador interno se ha quedado muy por detrás del de la superfamilia de S4 de potasio dependientes de voltaje (Kv) canales, para lo cual se han realizado una serie de afinidad nanomolar y péptidos moduladores selectivos de la toxina altamente descubiertos ^3. El veneno de abeja tertiapin toxina y sus derivados son potentes inhibidores de Kir1.1 y Kir3 canales de ^4,5, pero los péptidos son de uso limitado terapéuticamente así como experimentalmente, debido a sus propiedades antigénicas y una escasa biodisponibilidad, estabilidad metabólica y la penetrancia tejido. El desarrollo de potentesy selectivos de molécula pequeña sondas con mejores propiedades farmacológicas será una clave para un completo entendimiento de la fisiología y el potencial terapéutico de los canales Kir.

El Bibliotecas Molecular Sondas Centro de Producción de red (MLPCN), apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Fondo Común ha creado oportunidades para los científicos académicos para iniciar campañas de detección de la sonda para dianas moleculares y vías de señalización que necesitan una mejor farmacología ^6. El MLPCN ofrece a los investigadores acceso a los centros de cribado a escala industrial y química médica y la informática apoyar el desarrollo de pequeñas moléculas sondas para elucidar la función de los genes y las redes de genes. El paso crítico en la obtención de la entrada a la MLPCN es el desarrollo de un ensayo robusto diana específica o vía-que es susceptible de cribado de alto rendimiento (HTS).

Aquí se describe cómo desarrollar una fluorescencia basada en talio (Tl ⁺⁾ flujo ASSAy de Kir función del canal para la investigación de compuestos de alto rendimiento ^7,8,9,10. El ensayo se basa en la permeabilidad de la K ⁺ poro del canal para el K ⁺ Tl ⁺ congénere. A comercialmente disponibles fluorescente Tl ⁺ colorante reportero se utiliza para detectar flujo transmembrana de Tl ⁺ a través del poro. Hay por lo menos tres colorantes comercialmente disponibles que son adecuados para TL ⁺ ensayos de flujo: BTC, FluoZin-2, y Fluxor ^7,8. Este protocolo describe el desarrollo del ensayo utilizando FluoZin-2. Aunque originalmente desarrollado y comercializado como un indicador de zinc, FluoZin-2 exhibe un aumento robusto y dependiente de la dosis en la emisión de fluorescencia tras la unión Tl ^+. Comenzamos a trabajar con FluoZin-2 antes estaba disponible Fluxor ^7,8 y han seguido haciéndolo ^9,10. Sin embargo, los pasos en el desarrollo del ensayo son esencialmente idénticas para los tres tintes, y los usuarios deben determinar qué colorante es más apropiado para su específico nEEDS. También se discuten los puntos de referencia del ensayo de rendimiento que se deben alcanzar para ser considerado para la entrada en el MLPCN. Desde Tl ⁺ penetra fácilmente la mayoría de los canales de K ^+, el ensayo debe ser adaptable a la mayoría de los objetivos de los canales de K ^+.

Protocol

1. Generación de líneas celulares estables policlonales

1. El establecimiento de una línea celular estable que expresa la alta calidad del canal Kir de interés es un primer paso importante hacia el desarrollo de un sólido de alto rendimiento ensayo de cribado. Constitutiva sobreexpresión canal K ⁺ puede conducir a la activación de las vías de muerte celular, degeneración estable línea celular y la pérdida de rendimiento del ensayo. Para evitar estos posibles problemas y proporcionar un control interno conveniente para el desarrollo del ensayo (véase más abajo), un sistema de expresión inducible por tetraciclina se recomienda ^8.
2. ....

Results

El uso de un sistema de expresión inducible por tetraciclina proporciona un conveniente control interno para distinguir Tl ⁺ flujo a través de las vías endógenas y el canal Kir de interés. Figura 1 muestra algunos ejemplos de los mapas de galvanoplastia celulares utilizadas en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o tetraciclina inducida-se indican con diferentes colores. Figura 2A muestra el mapa de placa de fuent.......

Discussion

Tratamiento de datos: Una vez recogidos los datos, un paso común en el análisis consiste en la normalización de la respuesta de fluorescencia de cada pocillo, F, a su valor inicial al comienzo del experimento, F _0. Esto se conoce comúnmente como la "relación estática" y simbolizado "F / F ^_0". En los casos en que F ₀ está dominado por el colorante indicador de la relación de operación estática sustancialmente para corregir muchos factores ta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	El número de catálogo	Comentarios
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Inducible por tetraciclina vector de expresión
T-Rex-células HEK293	Invitrogen	R71007	La tetraciclina-inducible línea celular
LTX Lipofectamine / Plus reactivo	Invitrogen	15338100	Reactivo de transfección
FBS	ATLANTA Biológicos	S11550	Medios de cultivo celular
DMEM	Invitrogen	11965	Medios de cultivo celular
Higromicina B	Invitrogen	10687-010	Medios de cultivo celular
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Medios de cultivo celular
Penicilina / Estreptomicina	Invitrogen	15140	Medios de cultivo celular
HBSS-divalente libre	Mediatech	21022CV	Lavado de células
Tripsina 0,25%	Mediatech	25053CI	Disociación celular
Tetraciclina-HCl	Sigma	T9823	Inducción reactivo
FBS dializado	ATLANTA Biológicos	S12650	Medios de comunicación Revestimiento
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Colorante fluorescente
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye carga
HBSS	Invitrogen	14175	Tampón de ensayo
HEPES	Invitrogen	15630	Tampón de ensayo
NaHCO 3	Sigma	S6297	Tl + estímulo tampón
MgSO 4	Sigma	M2643	Tl + estímulo tampón
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + estímulo tampón
D-glucosa	Sigma	G7528	Tl + estímulo tampón
Sulfato de talio	Aldrich	204625	Tl + estímulo tampón
HEPES	Sigma	H4034	Tl + estímulo tampón
DMSO	Sigma	D4540	Solvente
Ocho canales pipeta electrónica	Biohit	E300	Célula de recubrimiento en el 384 -y placas
BD PureCoat amina recubiertos con placas de 384 pocillos	BD Biosciences	356719	Ensayo de microplacas
Echo calificado 384-así microplacas de polipropileno (384pp)	Labcyte	P-05525	Microplacas compuesto fuente
384-y microplacas de polipropileno	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi dispensador de reactivo	Thermo Scientific	5840300
ELx405 Lavador de microplacas	BioTek	ELx405HT	Lavado automático de células
Echo manipulador de líquidos	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automatizado plataforma de manejo de líquidos	Agilent Technologies	Modelo estándar
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging lector de placas