Hemos desarrollado un enfoque quirúrgico novedoso para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en el feto de ratón. La ruta de entrega es más eficiente en la orientación de los pulmones fetales de ratón que el comúnmente utilizado intraamniótica inyección. Este procedimiento hasta la fecha no se ha descrito en un modelo de ratón.
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Artículo de método
Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Entrega Prenatal pulmonar de células, genes o agentes farmacológicos podrían ser la base de nuevas estrategias terapéuticas para una variedad de enfermedades genéticas y adquiridas. Aparte de las anomalías congénitas o heredadas con el requisito de que a largo plazo la expresión del gen entregado, varias organizaciones no heredadas afecciones perinatales, donde a corto plazo la expresión génica o la intervención farmacológica es suficiente para lograr efectos terapéuticos, son considerados como posibles indicaciones futuras de este tipo de enfoque. Enfermedades candidatas para la aplicación de la terapia a corto plazo prenatal podría ser la deficiencia neonatal transitoria de la proteína surfactante B causando neonatal 1,2 síndrome de dificultad respiratoria o lesiones hyperoxic del pulmón neonatal 3. Enfermedades candidatos para la corrección terapéutica permanente son la fibrosis quística (FQ) 4, 5 variantes genéticas de deficiencia de surfactante y α1-antitripsina 6. <clase p = "jove_content"> En general, una ventaja importante de la terapia génica prenatal es la capacidad de iniciar una intervención terapéutica temprana en el desarrollo, en o incluso antes de que las manifestaciones clínicas en el paciente, evitando así daños irreparables a la persona. Además, los órganos fetales tienen una mayor tasa de proliferación celular en comparación con órganos de adultos, que podrían permitir un gen más eficiente o transferencia de células madre en el feto. Además, en la entrega de genes útero se realiza cuando el sistema inmune del individuo no es completamente maduro. Por lo tanto, el trasplante de células heterólogas o la suplementación de una proteína no funcional o ausente con una versión correcta no debería causar sensibilización inmune a la célula, el vector o producto transgénico, que ha sido recientemente demostrado ser el caso con las terapias celulares y genéticos 7 .
En el presente estudio, se investigó el potencial para tratar directamente la tráquea fetal en un ratón modelo. Este procedimiento está en uso en modelos animales más grandes tales como conejos y ovejas 8, e incluso en un entorno clínico 9, pero hasta la fecha no se ha realizado antes en un modelo de ratón. Cuando se estudia el potencial de la terapia génica fetal de enfermedades genéticas tales como la fibrosis quística, el modelo de ratón es muy útil como una primera prueba de concepto a causa de la amplia disponibilidad de diferentes cepas de ratones transgénicos, la embriogénesis bien documentado y el desarrollo fetal, menos estrictos normas éticas, gestación corta y el tamaño de la camada de gran tamaño.
Diversas vías de acceso se han descrito para dirigir el pulmón fetal de roedores, incluyendo la inyección intra-amniótico 10-12, (guiada por ultrasonido) intrapulmonar 13,14 inyección y la administración intravenosa en los vasos del saco vitelino 15,16 o vena umbilical 17. Nuestro procedimiento quirúrgico novedoso permite a los investigadores para inyectar el agente de elección directamente en la tráquea fetal de ratón que permitepara una entrega más eficaz de las vías respiratorias que las técnicas existentes 18.
Protocolo
1. El apareamiento de ratones obtener escenario deseado embarazo
Tiempo ratones NMRI compañero embarazadas de manera que sean de 18 días (E18) embarazadas (E19.5 de gestación total) en el momento de la cirugía. Antes y después de la cirugía que se alojan en jaulas filtro superior a la temperatura normal de la habitación y la luz del día normal, con libre acceso a agua y comida.
2. Fetal intratraqueal (IT) Inyección (Figura 1)
- Primero envíe la embarazada ratón NMRI a anestesia general con 1,5% de isoflurano en una mezcla de O 2 a 1,5 L / min. El nivel de isoflurano depende de la edad y la ce....
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Discusión
Los pasos críticos
- La cepa de ratón se optó por trabajar con ratones NMRI es porque tienen un abundante número de crías (tamaño medio de la camada 14,4 ± 1,8, datos propios), tolerar intervenciones bien y tienen buenas características maternas.
- Colocación del cordón de bolsa a través de la pared del útero y las membranas fetales es un paso fundamental, ya que sólo quieren exponer la cabeza del feto y no los hombros, de lo contrario es casi imposible reposición sin causar trauma.
- Una posició.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
MC y AVDP son becarios de doctorado apoyados por subvenciones del Instituto para el Fomento de la Innovación mediante la Ciencia y la Tecnología en Flandes (IWT-Vlaanderen). JT tiene una beca a tiempo parcial Investigación Clínica (KOOR) de UZ Leuven. DV es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención de KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención del Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) y Erasmus Mundus. La investigación fue financiada por IWT-Vlaanderen, por el DIMI CE subvención (LSHB-CT-2005 a 512,146) y por el In vivo Molecular Imaging Research grupo (Imir) de la KU Leuven. Nos g....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| NMRI ratones | Janvier, Le St Genest Isle, Francia | ||
| El isoflurano | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Reino Unido | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica | ||
| 50 l Hamilton jeringa de vidrio, Modelo 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, EE.UU. | 5495-20 | |
| 30G aguja afilada | Hamilton, Reno, NV, EE.UU. | 7762-03 | |
| Xilocaína al 2% | AstraZeneca, Zoetermeer, Países Bajos |
Referencias
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infa....
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Reimpresiones y permisos
