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Artículo de método

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

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DOI:

10.3791/4274

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20 de diciembre de 2012

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1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Primario, fetales humanos derivado del cerebro, células progenitoras multipotenciales proliferan In vitro Mientras se mantiene la capacidad de diferenciarse en neuronas y astrocitos. Este trabajo muestra que los progenitores neurales pueden ser inducidas a diferenciarse a través de las etapas del linaje oligodendrocíticos por aire con factores de crecimiento seleccionados.

Resumen

La diferenciación de los progenitores neurales humanas en tipos de células neuronales y gliales ofrece un modelo para estudiar y comparar la regulación molecular del desarrollo neural linaje celular. Expansión in vitro de células progenitoras neurales a partir de tejido del SNC fetal ha sido bien caracterizado. A pesar de la identificación y el aislamiento de células progenitoras gliales de adulto humano sub-cortical materia blanca y el desarrollo de diversas condiciones de cultivo para la diferenciación directa de progenitores neurales fetales en oligodendrocitos de mielina producir, adquirir suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil. Diferenciación de galactocerebrósido + (GalC) y O4 + precursoras de oligodendrocitos o células progenitoras (OPC) a partir de células precursoras neurales ha informado mediante cerebro fetal segundo trimestre. Sin embargo, estas células no proliferan en ausencia de células de apoyo incluyendo los astrocitos y las neuronas, y se pierden rápidamente con el tiempo en cultivo. Persiste la necesidad de un sistema de cultivo para producir las células del linaje de oligodendrocitos adecuado para la experimentación in vitro.

Cultura de oligodendrocitos humanos primarios podría, por ejemplo, ser un modelo útil para estudiar la patogénesis de la neurotrópicos agentes infecciosos como el virus de polioma humano, JCV, que in vivo infecta las células. Estas células cultivadas también podrían proporcionar modelos de otras enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central (SNC). Primario, humano fetal derivado del cerebro, las células progenitoras neurales multipotenciales proliferan in vitro, mientras que el mantenimiento de la capacidad de diferenciarse en neuronas (neuronas derivadas progenitor-, PDN) y astrocitos (derivado progenitor-astrocitos, PDA) Este estudio muestra que los progenitores neurales pueden ser inducidas para diferenciar a través de muchas de las etapas del desarrollo de linaje oligodendrocíticos (derivado progenitor-oligodendrocitos, PDO). Nosotros, las células progenitoras neurales en cultivo DMEM-F12 sin suero supcomplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 y triyodotironina (T3). Las células cultivadas se someten a pasadas en células 2.5e6 por matraces de 75 cm aproximadamente cada siete días. Usando estas condiciones, la mayoría de las células en cultivo mantener una morfología caracterizada por pocos procesos y expresan marcadores de oligodendrocitos pre-células, tales como A2B5 y O 4-. Cuando eliminar los factores de crecimiento de cuatro (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) y añadir medio acondicionado de PDN, las células comienzan a adquirir más procesos y expresan marcadores específicos de diferenciación de oligodendrocitos, tales como GalC y de la mielina proteína básica (MBP). Se realizó la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo multicolor para identificar marcadores únicos de oligodendrocitos.

Protocolo

Nota: Para el cultivo de rutina de las células progenitoras neurales y oligodendrocíticos linaje, la incubación se realiza a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 atmósfera. Cada 2 días, el medio se sustituye con 50 a 100% de medio fresco si la cultura es 40-70% de confluencia. En el momento de confluencia cerca, los cultivos se pasaron a 2-2.5e6/T75 matraz por lo general con un programa semanal.

1. Preparación del frasco recubierto

  1. Para preparar matraces recubiertos diluir 5 mg de poli-D-lisina (PDL) en 100 ml de agua desionizada (DI-agua), luego capa matraces T75 con 50 ug / ml de PDL a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Después de 1 ½ hr, aspirar el PDL y enjuague los frascos una vez con DI-agua. Que los matraces secos antes de la siembra de las células (Tabla 1).

2. A partir diferenciación de células progenitoras neurales progenitoras en oligodendrocitos derivados (DOP)

El protocolo esolato humanos células progenitoras del SNC se describe en una publicación anterior y no es parte de este protocolo 1. Humanos de las células progenitoras del SNC se aislaron a partir del telencéfalo de un cerebro 8-semanas de gestación fetal, obtenido de acuerdo con las directrices del NIH.

  1. Grow población multipotencial de las células progenitoras neurales en PDL matraces recubiertos en medio neurobasal suplementado con 25 ng / ml de bFGF y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Figura 1A). No los use si es superior a paso 11 (p11).
  2. Iniciar para diferenciar las células progenitoras neurales cuando el cultivo es de aproximadamente 70% de confluencia.
  3. Hacer medio de diferenciación de oligodendrocitos completa utilizando suero libre de DMEM / Hams F12 01:01 suplementado con albúmina de suero bovino, L-glutamina, gentamicina, componentes N2, T3, Shh, NT-3, bFGF y PDGF-AA (Tabla 1) . Este medio se define como medio oligo con factores de crecimiento (oligo medio GF +).
  4. Retire Progenmedios Itor de los matraces, enjuagar las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación se añade medio de oligo + GF (detalles descritos en 2,3) para iniciar la diferenciación de oligodendrocitos. Sólo las células comprometidas con el linaje oligodendrocíticos crecerá (Figura 1B). Cultivar las células en este medio durante 3 semanas.
  5. Cada semana, cuando las células están en 90-95% de confluencia, paso utilizando tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml para un matraz T75). Pasar el medio completo de las células a ser pasados ​​en un tubo cónico de 50 ml; este medio acondicionado se utiliza para apagar la tripsina. Asegúrese de que no se sequen las células. A continuación, añadir tripsina.
  6. Se incuban las células en tripsina durante 5 min a TA, golpeando suavemente el matraz varias veces para ayudar desprendimiento celular.
  7. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 4-5 ml de medio condicionado al matraz con las células separadas.
  8. Pasar el medio y las células con el mismo tubo de 50 ml cónico. Se centrifuga el medio y las células a 1.200 rpm (~300 xg) durante 5 min a TA.
  9. Aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular, inclinando suavemente el tubo y, a continuación añadir medio fresco oligo + GF. Suavemente medio de la pipeta y las células arriba y abajo para realizar una suspensión celular uniforme.
  10. Contar las células y 2.5e6 de transferencia en cada nueva PDL recubierto matraz T75.

3. Etapa Final en la diferenciación de oligodendrocitos

  1. Después de 3 semanas de cultivo en medio oligo + GF, cuando las células están en 70-80% de confluencia, inicie el proceso final de la diferenciación (Figura 1C).
  2. Preparar el medio de la misma manera como el medio de oligo + GF pero sin añadir el GF cuatro: Shh, NT-3, bFGF y PDGF-AA. Este medio sin el GF cuatro se define como medio oligo - GF.
  3. Aspirar el medio oligo + GF del matraz, se lava una vez con PBS y luego añadir un volumen total de 16 ml de medio, de los cuales ¾ (12 ml) es oligo medio - GF y ¼ (4 ml) es medio acondicionado PDN, por 6-10 Días). El uso de medio acondicionado de PDN no es crítica para el proceso de diferenciación o la supervivencia de las células. Hemos observado que, de hecho, sólo el contacto directo de las células con DOP con NEM en experimentos de co-cultivo tuvo un efecto sobre la duración de la supervivencia PDO. El tiempo de supervivencia medio en oligo - GF podría prolongarse a dos o tres semanas si las células PDO se co-cultivadas con células NEM. El protocolo para diferenciar las células progenitoras neurales en PDN se describe en una publicación anterior y no es parte de este protocolo 1. Crecimiento factor de retirada de los resultados del medio de cultivo en cultivo progresivamente diferenciadas de células con múltiples procesos (Figura 1D).

4. Ensayo de citometría de flujo

El ensayo de citometría de flujo se compara la adquisición de marcadores de oligodendrocitos durante el proceso de diferenciación en relación con los de la población parental.

  1. Use pro neuralgenitores como control. Semillas DOP células en 2.5x10 6 células en dos matraces T75 recubiertos con poli-D-lisina en medio de oligo + GF.
  2. Una semana más tarde, sustituir medio con medio fresco oligo + GF en matraces como un cultivo de control para la viabilidad celular, mientras que otros frascos tenía medio oligo - GF.
  3. Para disociar células PDO en ambos medios utilizar 20 U / ml de papaína y tripsina no. Esto es debido a la papaína tiene un efecto suave con las células durante la disociación preservar la morfología celular.
  4. Añadir 5 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) a un vial de papaína. Colocar el vial a 37 º C durante 10 min o hasta que la papaína está completamente disuelta y la solución aparece clara. Esta es la solución de papaína utilizado para disociar las células.
  5. Añadir 0,5 ml de EBSS a una desoxirribonucleasa I (ADNasa) vial (Tabla 1). Mezclar suavemente. Añadir 0,25 ml de esta solución en el vial de la papaína disuelto. Esta preparación contiene una concentración final de aproximadamente 20 U / ml de papaína y 00.005% DNasa.
  6. Place papaína solución (como se describió anteriormente) en las células y se incuba a 37 ° C durante 15-30 min; controlar el desprendimiento de las células utilizando un microscopio. Detener la reacción con 5 ml de medio con o sin GF y centrifugar a 1.200 rpm durante 7 min.
  7. Transferir los sedimentos celulares de ambos matraces en dos diferentes tubos de 5 ml de polipropileno y lavar con medio fisiológico normal (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM Hepes y 10 mM de glucosa) suplementado con 1 mg / ml albúmina de suero bovino (BSA + NPM).
  8. Realizar superficie inmunotinción a 4 º C durante 20 min utilizando anticuerpos primarios específicos y se titula apropiadamente para A2B5, O4, GalC (Tabla 2).
  9. Lavar las células con NPM + BSA a 4 ° C durante 5 min y se incuban con anticuerpos secundarios específicos a 4 º C durante 20 min (Tabla 2).
  10. Para la tinción de antígenos intracelulares incluyendo nestina, proteína ácida glial fibrilar (GFAP), clase III y serta;-tubulina y la proteína básica de la mielina (MBP) (Tabla 2), fijar las células en 2% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a TA y se permeabilizan con etanol frío al 70% durante 15 min a -20 ° C.
  11. Lavar las células con PBS 1x y se incuban con anticuerpos secundarios específicos (Tabla 2).
  12. Para discriminar entre las células intactas y los desechos subcelular durante el análisis de citometría de flujo, tinción de células con 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihidrocloruro (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. En la optimización del protocolo anterior, hemos realizado todos los experimentos de control adecuadas para confirmar la especificidad de cada inmunorreactivo. En resumen, para los anticuerpos marcados directamente, el control negativo apropiado era un anticuerpo conjugado directamente de la clase de inmunoglobulina mismo isotipo (o subclase) y conjugado con fluorocromo como el anticuerpo primario (es decir, el control de isotipo). Para inmunotinción indirecta de anticuerpos primarios, el adecuado control negativo wcomo el anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo de interés que específicamente la clase de inmunoglobulina (o subclase) de la máquina en la que se generó el anticuerpo primario. Cuando los anticuerpos primarios desde múltiples hosts (ratón, conejo, pollo) se utilizan conjuntamente, se utilizó el anticuerpo secundario dirigido el anticuerpo primario de cada host y cada anticuerpo secundario utilizado fue típicamente cruzada adsorbida contra las inmunoglobulinas de los otros anfitriones para minimizar cruzada acoger inmunorreactividad. Los controles positivos incluidos inmunotinción directa o indirecta de preparaciones de células se sabe que expresan los antígenos de interés usando ya sea inmunorreacciones directa o indirecta con los anticuerpos primarios específicos para estos antígenos. Los métodos de optimización más arriba se han llevado a cabo una vez por cada tipo de inmunotinción experimentos. Inmunorreacciones controles no reveló cruzada significativa epítopo inmunoreactividad entre los anticuerpos primarios y secundarios. Citometría de flujo se realizó en uniformementesuspendidas las células marcadas con fluorescencia utilizando un clasificador de células FACVantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado con tres rayos láser, que proporcionan longitudes de onda de excitación sintonizados a 488 nm, 647 nm, y un amplio UV (351-364 nm) (Figura 2) .

5. Ensayo de inmunofluorescencia

Nota: Para los experimentos de inmunofluorescencia, PDO se sembraron en medio oligo + GF o medio oligo - GF en 2.5e5 en placas de 6 pocillos recubiertas con PDL. Las células se fijan en 2% de PFA en diversos puntos temporales después de la retirada de factores de crecimiento. El anticuerpo mancha se realiza en placas de 6 pocillos de plástico en lugar de cubreobjetos de vidrio.

  1. Retire el medio y añadir el 2% PFA. Incubar durante 10 min a TA. Deseche PFA. Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez. Tenga cuidado de no secar las células.
  2. Permeabilizar las células para marcadores intracelulares utilizando 0,25% de solución de Triton en PBS durante 10 min a TA.
  3. Para evitar que las células no específicas vinculantes, bloque fo 10 min con HHG (1 mM de tampón HEPES, 2% de suero de caballo, y 10% de suero de cabra en solución salina equilibrada de Hanks). Diluir específicos anticuerpos primarios (Tabla 2) para una concentración predeterminada en HHG. Coloque anticuerpos diluidos sobre las células. Incubar 1 hora a temperatura ambiente con agitación mecánica o a 4 º C durante la noche.
  4. Lavar las células 3 veces con PBS, durante 5 min cada vez. Diluir anticuerpos secundarios apropiados (Tabla 2) junto con un fluorocromo a una concentración predeterminada en HHG. Coloque la mezcla diluida de anticuerpos secundarios en las células. Incubar 1 hora a temperatura ambiente en un agitador en la oscuridad.
  5. Lavar las células 3 veces con PBS, durante 5 min cada vez.
  6. Para evitar photobleaching añadir 10 l de prolongar oro con DAPI a las células y colocar un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de ellos. Visualizar las células marcadas utilizando un microscopio de fluorescencia Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3).

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Resultados

Es muy importante para iniciar el proceso de diferenciación de un 70% -80% confluentes cultura neural de células progenitoras (Figura 1A). Muchas células morirán después de cambiar el medio de cultivo a partir de progenitor a medio oligo ya que incluye factores de crecimiento específicos. Esto indica que el crecimiento de las células progenitoras neurales no comprometidos a un fenotipo oligodendrocíticos no será soportado por el nuevo medio (Figura 1B). La incubación en medio oligo + GF...

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Discusión

Este protocolo describe la forma de obtener los oligodendrocitos fetales a partir de células humanas primarias progenitoras neurales y caracterizar su fenotipo utilizando tanto la citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia. La expansión y el crecimiento de células progenitoras neurales fetales desde CNS ha sido muy bien descrita 1-4. Sin embargo, la obtención de suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil, a pesar de que es posible ide...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud, NINDS. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Laboratorio de Medicina Molecular y Neurociencias, Rick Dreyfuss por ayudar con microscopía y tamizado Pamela C. por su ayuda en la edición.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Concentración final
DME / JAMONES F12 01:01 Omega Científico DM-251 1X
Albúmina bovina Sigma A9418 1%
Gentamicina Calidad de Productos Biológicos 120-098-031 50 ug / ml
L-Glutamina Calidad de Productos Biológicos 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Componentes Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng / ml
Shh R & D System 1314-SH/CF 2 ng / ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng / ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng / ml
PDL Sigma P6407 50 g / m
PFA Microscopía Electrónica de Ciencias 15712 2%
Tripsina Calidad de Productos Biológicos 118-087-721
Papaína Worthington LK003178 20 U / ml
DNasa viales Worthington LK003172 0,005%
EBSS Worthington LK003188
Prolongar Oro
conDAPI 		Invitrogen P36931

Tabla 1. Reactivos.

Primaria Abs (todos a 1 mg / ml) Especies Isotipo Fuente Secundaria Abs
Citometría de Flujo
A2B5-Biotina Ratón IgM Regalo J. Nielson Estreptavidina PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Ratón IgM Regalo de J. Nielson
A2B5 Ratón IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Ratón IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Ratón IgG 3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Pollo IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Ratón IgG 1 Messam et al. 2000 28 gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Conejo IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulina Ratón IgG 2 Covance, CA gαm IgG-2 a PETR, Invitrogen, CA
La inmunocitoquímica
βIII tubulina
(1:1,500) 		Ratón IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Conejo IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50) 		Pollo IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Ratón IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1: 100)
GalC
(1:10) 		Conejo IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

. Tabla 2 anticuerpos (Abs) utilizados para la citometría de flujo y ensayos de inmunocitoquímica conjugados de anticuerpos: PE, ficoeritrina; PETR, ficoeritrina Texas Red; AMCA, amino-metil-cumarina-acetato; Cy, cianina; FITC, isotiocianato de fluoresceína. Ig: inmunoglobulina. . AF: Alexa Fluor; gαm: de cabra anti-ratón; gαrb: de cabra anti-conejo; dαck: burro anti-pollo.

Referencias

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