El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

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DOI:

10.3791/4423

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21 de mayo de 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe una técnica experimental para el tratamiento de defectos osteocondrales en la articulación de la rodilla del conejo. La implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en defectos osteocondrales proporciona un desarrollo prometedor en el campo de la ingeniería de tejidos. La preparación de la fibrina por células coágulos In vitro Ofrece un método estandarizado para la implantación.

Resumen

El tratamiento de los defectos osteocondrales articulares ha representado un desafío para los médicos durante muchos años. La mejor comprensión de las interacciones entre el cartílago articular y el hueso subcondral en los últimos años ha llevado a un mayor enfoque en la restauración de toda la unidad osteocondral. En comparación con las lesiones condrales, la regeneración de defectos osteocondrales es mucho más compleja y representa un reto quirúrgico y terapéutico considerablemente mayor. El tejido dañado no solo incluye la capa superficial de cartílago, sino también el hueso subcondral. En el caso de daños osteocondrales profundos, como los que ocurren por ejemplo en la osteocondritis disecante, es necesario reemplazar todo el espesor del defecto para restaurar la superficie articular ¹. Los procedimientos terapéuticos adecuados deben tener en cuenta estos dos tejidos diferentes y sus distintos potenciales de curación intrínsecos ². En las últimas décadas, han surgido varias opciones de tratamiento quirúrgico que ya se han establecido clínicamente ^3-6.

Los trasplantes osteocondrales autólogos o alogénicos consisten en cartílago articular y hueso subcondral y permiten el reemplazo de toda la unidad osteocondral. Los defectos se rellenan con injertos osteocondrales cilíndricos que buscan proporcionar una superficie recubierta de cartílago hialino congruente ^3,7,8. Las desventajas son la cantidad limitada de injertos disponibles, la morbilidad en el sitio donante (para trasplantes autólogos) y la incongruencia de la superficie; por ello, la aplicación de este método está especialmente limitada en defectos grandes.

Nuevos enfoques en el campo de la ingeniería de tejidos han abierto posibilidades prometedoras para la terapia regenerativa osteocondral. La implantación de condrocitos autólogos marcó el primer enfoque biológico basado en células para el tratamiento de lesiones cartilaginosas de espesor completo y actualmente está establecida a nivel mundial con buenos resultados clínicos incluso 10 a 20 años después de la implantación ^9,10. Sin embargo, hasta la fecha, esta técnica no es adecuada para el tratamiento de todos los tipos de lesiones, como defectos profundos que afectan al hueso subcondral ¹¹.

La técnica del sándwich combina el injerto óseo con los enfoques actuales en ingeniería de tejidos ^5,6. Esta combinación parece capaz de superar las limitaciones observadas con los injertos osteocondrales por sí solos. Tras el injerto óseo autólogo en la zona del defecto subcondral, se sutura encima una membrana sembrada con condrocitos autólogos, lo que facilita que la topología del injerto coincida con el sitio lesionado. Por supuesto, la reconstrucción ósea previa requiere tiempo quirúrgico adicional y, a menudo, incluso una cirugía adicional. Además, hasta la fecha, faltan datos a largo plazo ¹².

La ingeniería de tejidos sin injerto óseo adicional tiene como objetivo restaurar la estructura compleja y las propiedades del cartílago articular nativo mediante el potencial condrogénico y osteogénico de las células trasplantadas. Sin embargo, una vez más, por lo general solo se regenera más o menos el tejido cartilaginoso. Los daños osteocondrales adicionales requieren un tratamiento específico adicional. Con el fin de lograr una regeneración de la estructura multicapa de los defectos osteocondrales, los productos tridimensionales de ingeniería de tejidos sembrados con células autólogas/alógenas podrían proporcionar una buena capacidad regenerativa ¹¹.

Además de los condrocitos autólogos, las células madre mesenquimales (MSC) parecen ser una alternativa atractiva para el desarrollo de un tejido cartilaginoso de espesor completo. En numerosos estudios preclínicos in vitro e in vivo, las células madre mesenquimales han mostrado un excelente potencial de regeneración tisular ^13,14. La ventaja importante de las células madre mesenquimales, especialmente para el tratamiento de defectos osteocondrales, es que tienen la capacidad de diferenciarse tanto en osteocitos como en condrocitos. Por lo tanto, potencialmente permiten una regeneración multicapa del defecto.

En los últimos años, por lo tanto, se han desarrollado y evaluado varios andamiajes con potencial regenerativo osteocondral, obteniéndose resultados preliminares prometedores ^1,15-18. Además, el pegamento de fibrina como vehículo de células se ha convertido en una de las técnicas preferidas en la reparación experimental del cartílago y ya se ha utilizado con éxito en varios estudios en animales ^19-21 e incluso en los primeros ensayos humanos ²².

El siguiente protocolo demostrará una técnica experimental para aislar células madre mesenquimales de la médula ósea de un conejo, para su posterior proliferación en cultivo celular y para preparar un modelo estandarizado in vitro de coágulos de células en fibrina. Finalmente, se describirá una técnica para la implantación de coágulos de células en fibrina previamente establecidos en defectos osteocondrales artificiales de la articulación de la rodilla del conejo.

Protocolo

A. Preparación de un conejo de Donantes para el aislamiento de células madre mesenquimales (Surgery Room)

Las células se aíslan a partir Zealand White (NZW) conejos de Nueva masculinos en edad de 4 meses y aproximadamente 3 kg de peso corporal.
Inducir la anestesia por el propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) y sacrificar con pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal iv).
Afeitarse la piel de las extremidades posteriores, la espalda y el vientre con una maquinilla eléctrica y aspirar la piel.
Desinfectar la zona de afeitado a fondo con etanol al 70%.
El uso de fórceps romos, tijeras afiladas (o bisturí) y cortadores de huesos de tejidos y ligamentos.
Hacer una incisión a lo largo de la superficie craneal de la pierna y la pantorrilla.
Reflejar la piel y el tejido subcutáneo por cualquiera de disección cortante o contundente.
Músculos separados y ligamentos de la tibia y el fémur. Mantenga los cortes lo más cerca al hueso de lo posible para hacer una disección limpia. No separar fémur de la tibia en este momento.
Cortar THRough la articulación de la cadera para separar la cabeza del fémur del acetábulo.
Eleve el complejo tibial-femoral.
Utilice la hoja de bisturí para raspar el tejido blando restante de los huesos o frotar los huesos con los tejidos de tela estériles. En este punto, el fémur y la tibia están todavía conectados.
Retire la rótula por el corte, y luego cortar los ligamentos de rodilla a los huesos separados finalmente.
Vaporizador separa los huesos con etanol al 70%, dejar secar al aire y colocar cada hueso en un tubo de centrífuga de 50 ml con medio de cultivo celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep)) para mantener la humedad.
Ahora cambie bajo una campana de flujo laminar cultura celular estéril.

B. Lavado de MSC Conejo de huesos y de expansión (cultivo celular Hood)

Recoger los huesos de los tubos y colocarlos en placas de 150 mm con pinzas estériles.
Retire ambos extremos con una sierra estéril y mover las piezas a nuevos platos de 150 mm de hueso.
Llene una jeringa de 10 ml con medium (DMEM), conecte una aguja de calibre 18 y se insertan en la apertura de la médula ósea.
Luego, enjuague la cavidad ósea con medio para eliminar la médula ósea en el plato. Después, enjuague desde el otro extremo, si es posible. Si es necesario, serrar más de los extremos. Si el hueso se rompe, simplemente enjuague el interior del hueso.
Aspirar el medio de suspensión celular en la jeringa y enjuague la médula ósea varias veces hasta que la suspensión es de libre flotación a través de la cavidad de la médula ósea y el hueso aún no aparecen de médula coágulos.
Una vez que la médula ósea ha sido recolectada de todos los huesos, interrumpir los grupos de médula al pasar a través de una aguja de calibre 18: Llene la jeringa con aguja incorporada y obligarlo a cabo en el medio.
Después, filtrar la suspensión a través de un filtro de células en un tubo de 50 ml. Con el fin de prevenir la pérdida de células, lavar la cultura plato 2x con 10 ml de medio y filtrar así.
Centrifugar la suspensión a 500 xg durante 5 min a TA.
Aspirar el sobrenadante y resuspender células pelly en medio de 10 ml (DMEM + 1% penicilina / estreptomicina).
Separa las células de la sangre de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células madre mesenquimales (MSC) utilizando una solución de separación Biocoll.
Llenar 5 ml de solución de separación Biocoll en un tubo de 15 ml y añadir cuidadosamente 5 ml de suspensión celular en la parte superior y se centrifuga a 800 xg durante 20 min a TA (sin freno).
Los posibles resultados ver la figura 1: Ser más denso que Biocoll, las células rojas de la sangre de sedimentos a la parte inferior, mientras que las células madre mesenquimales de PBMC y se mantienen en la interfaz.
Retire con cuidado la interfaz en un tubo de 15 ml y lavar con 5 ml de PBS.
Se centrifuga como se describe en el paso 22, resuspender en 5 ml de PBS y repetir 2 a 3 veces.
A continuación, se centrifuga de nuevo a 350 xg durante 10 min a TA (con freno).
Resuspender en 10 ml de medio y contar las células en un hemocitómetro.
Células de la placa en una densidad inicial de siembra de aproximadamente 5 x 10 ⁶ en platos de 150 mm.
Después de 2-3 días, vuelva amover las células no adherentes. Puede que tenga que enjuagar con PBS primero con el fin de eliminar los restos celulares. Añadir medio completo fresco (DMEM + 10% suero de ternera fetal (FCS) + 1% Pen / Strep) después.
Alimentar a las células cada 3-4 días (Figura 2).
Después de 5-10 días, el paso de las células, por primera vez.

C. Preparación de coágulos de fibrina in vitro

En el día de la implantación, liberar las células adherentes de matraces / platos por una exposición de 3 min-al 0,25% de tripsina-EDTA. Detener tripsinización mediante la adición de medio completo.
Distribuir las células en un tubo de 50 ml Falcon y lavar dos veces con PBS.
Determinar la viabilidad celular y números mediante tinción con azul tripán.
Añadir 50,000 células / tubo de microcentrífuga y recoger gránulos mediante centrifugación a 500 xg durante 5 min a TA. Preparar una mezcla maestra para al menos un coágulo más según sea necesario.
Resuspender el sedimento celular en 17 l de PBS y mezclar 25 l de la componente de fibrinógeno de TISSUCOL-Kit con esta suspensión MSC 17 l.
Tome una placa estéril con agujeros pre-perforados (3x3.6 mm) de acuerdo a los agujeros de perforación en vivo (Figura 3).
En primer lugar, inocular 4 l de solución de trombina (500 UI / ml) en un agujero, seguido de la adición inmediata de 42 l de fibrinógeno-suspensión de células y de nuevo 4 l de solución de trombina en la parte superior. No mezcle la suspensión para evitar la coagulación de la punta de la pipeta. En primer lugar, el volumen de 50 l del fibrinógeno-suspensión celular pipeteado sobresaldrá del borde de los agujeros previamente perforados sin fundir debido a la tensión superficial. Sin embargo, después de la coagulación completa (después de 60 min) el coágulo se contrae y se ajusta en el orificio previamente perforado.
Retire el coágulo con cuidado unas pinzas romas y colocar en un tubo de microcentrífuga con PBS. Preparar 2 coágulos / animal.
Tome los coágulos a la sala de cirugía.

D. La implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

Inducir la anestesia para conejo (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de edad) mediante inyección iv de propofol (10 mg / kg de peso corporal).
Afeitado de la rodilla para ser operado con una maquinilla eléctrica y el vacío de la piel. Todos los procedimientos mencionados antes se llevan a cabo en una sala de preparación de la cirugía para evitar la contaminación del medio ambiente estéril de la sala de operaciones.
Después de la intubación, mantener la anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol y 0,05 mg / kg / min de fentanilo por vía intravenosa. Supervisar la anestesia mediante capnografía, pulsioximetría y el pulso.
Desinfectar la rodilla afeitado a fondo y cubrir el resto de conejo con un apósito estéril.
Palpar la rótula y realizar una incisión medial de la rótula.
Abra la articulación de la rodilla por una artrotomía parapatelar medial en condiciones estériles. Trate de evitar el corte de los pequeños vasos sanguíneos superficiales.
Plegar la rótula lateralmente (Figura 4).
Después de Inspección de la articulación de la rodilla de las lesiones del cartílago concomitantes o anomalías conjuntas, crear dos defectos osteocondrales (3 mm de profundidad, la figura en forma de ocho) en el surco troclear con un taladro eléctrico operativo aire estéril (3,6 mm de diámetro) con un stop-dispositivo (Figura 5).
Limpie los defectos y enjuague con solución salina estéril.
Antes de la implantación, llenar 20 l de la cola de fibrina en los defectos y distribuirlas uniformemente sobre la parte inferior del defecto.
Entonces implantar los coágulos ajustado a presión en el defecto de la figura en forma de ocho.
Después de la coagulación, la ubicación de la rótula en el surco troclear y doblar y estirar la rodilla un par de veces.
Desplazar la rótula lateralmente una vez más y comprobar si las células fibrinógeno-coágulos son todavía en su lugar.
Vuelva a colocar la rótula de nuevo y terminar la operación con el cierre de heridas en capas con suturas solo botón (4-0 Vicryl) y una sutura cutánea continua (4-0 Monocryl) (ambos con sutura absorbiblemateriales).
Por último, sellar la herida con un apósito de pulverización permeable al vapor de agua.
Para el cuidado post-operatorio, la herida se comprueba al día durante 7 días. Los conejos reciben para la analgesia postoperatoria carprofeno 4 mg / kg por vía subcutánea cada 24 horas (durante 4 días) y buprenorfina 0,03 mg / kg sc cada 12 h (durante 2,5 días). Una estabilización de la rodilla (por ejemplo, vendaje) no es necesario.