Se describe una técnica experimental para el tratamiento de defectos osteocondrales en la articulación de la rodilla del conejo. La implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en defectos osteocondrales proporciona un desarrollo prometedor en el campo de la ingeniería de tejidos. La preparación de la fibrina por células coágulos In vitro Ofrece un método estandarizado para la implantación.
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Artículo de método
El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina
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Resumen
Resumen
El tratamiento de los defectos osteocondrales articulares ha representado un desafío para los médicos durante muchos años. La mejor comprensión de las interacciones entre el cartílago articular y el hueso subcondral en los últimos años ha llevado a un mayor enfoque en la restauración de toda la unidad osteocondral. En comparación con las lesiones condrales, la regeneración de defectos osteocondrales es mucho más compleja y representa un reto quirúrgico y terapéutico considerablemente mayor. El tejido dañado no solo incluye la capa superficial de cartílago, sino también el hueso subcondral. En el caso de daños osteocondrales profundos, como los que ocurren por ejemplo en la osteocondritis disecante, es necesario reemplazar todo el espesor del defecto para restaurar la superficie articular 1. Los procedimientos terapéuticos adecuados deben tener en cuenta estos dos tejidos diferentes y sus distintos potenciales de curación intrínsecos 2. En las últimas décadas, han surgido varias opciones de tratamiento quirúrgico que ya se han establecido clínicamente 3-6.
Los trasplantes osteocondrales autólogos o alogénicos consisten en cartílago articular y hueso subcondral y permiten el reemplazo de toda la unidad osteocondral. Los defectos se rellenan con injertos osteocondrales cilíndricos que buscan proporcionar una superficie recubierta de cartílago hialino congruente 3,7,8. Las desventajas son la cantidad limitada de injertos disponibles, la morbilidad en el sitio donante (para trasplantes autólogos) y la incongruencia de la superficie; por ello, la aplicación de este método está especialmente limitada en defectos grandes.
Nuevos enfoques en el campo de la ingeniería de tejidos han abierto posibilidades prometedoras para la terapia regenerativa osteocondral. La implantación de condrocitos autólogos marcó el primer enfoque biológico basado en células para el tratamiento de lesiones cartilaginosas de espesor completo y actualmente está establecida a nivel mundial con buenos resultados clínicos incluso 10 a 20 años después de la implantación 9,10. Sin embargo, hasta la fecha, esta técnica no es adecuada para el tratamiento de todos los tipos de lesiones, como defectos profundos que afectan al hueso subcondral 11.
La técnica del sándwich combina el injerto óseo con los enfoques actuales en ingeniería de tejidos 5,6. Esta combinación parece capaz de superar las limitaciones observadas con los injertos osteocondrales por sí solos. Tras el injerto óseo autólogo en la zona del defecto subcondral, se sutura encima una membrana sembrada con condrocitos autólogos, lo que facilita que la topología del injerto coincida con el sitio lesionado. Por supuesto, la reconstrucción ósea previa requiere tiempo quirúrgico adicional y, a menudo, incluso una cirugía adicional. Además, hasta la fecha, faltan datos a largo plazo 12.
La ingeniería de tejidos sin injerto óseo adicional tiene como objetivo restaurar la estructura compleja y las propiedades del cartílago articular nativo mediante el potencial condrogénico y osteogénico de las células trasplantadas. Sin embargo, una vez más, por lo general solo se regenera más o menos el tejido cartilaginoso. Los daños osteocondrales adicionales requieren un tratamiento específico adicional. Con el fin de lograr una regeneración de la estructura multicapa de los defectos osteocondrales, los productos tridimensionales de ingeniería de tejidos sembrados con células autólogas/alógenas podrían proporcionar una buena capacidad regenerativa 11.
Además de los condrocitos autólogos, las células madre mesenquimales (MSC) parecen ser una alternativa atractiva para el desarrollo de un tejido cartilaginoso de espesor completo. En numerosos estudios preclínicos in vitro e in vivo, las células madre mesenquimales han mostrado un excelente potencial de regeneración tisular 13,14. La ventaja importante de las células madre mesenquimales, especialmente para el tratamiento de defectos osteocondrales, es que tienen la capacidad de diferenciarse tanto en osteocitos como en condrocitos. Por lo tanto, potencialmente permiten una regeneración multicapa del defecto.
En los últimos años, por lo tanto, se han desarrollado y evaluado varios andamiajes con potencial regenerativo osteocondral, obteniéndose resultados preliminares prometedores 1,15-18. Además, el pegamento de fibrina como vehículo de células se ha convertido en una de las técnicas preferidas en la reparación experimental del cartílago y ya se ha utilizado con éxito en varios estudios en animales 19-21 e incluso en los primeros ensayos humanos 22.
El siguiente protocolo demostrará una técnica experimental para aislar células madre mesenquimales de la médula ósea de un conejo, para su posterior proliferación en cultivo celular y para preparar un modelo estandarizado in vitro de coágulos de células en fibrina. Finalmente, se describirá una técnica para la implantación de coágulos de células en fibrina previamente establecidos en defectos osteocondrales artificiales de la articulación de la rodilla del conejo.
Protocolo
A. Preparación de un conejo de Donantes para el aislamiento de células madre mesenquimales (Surgery Room)
- Las células se aíslan a partir Zealand White (NZW) conejos de Nueva masculinos en edad de 4 meses y aproximadamente 3 kg de peso corporal.
- Inducir la anestesia por el propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) y sacrificar con pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal iv).
- Afeitarse la piel de las extremidades posteriores, la espalda y el vientre con una maquinilla eléctrica y aspirar la piel.
- Desinfectar la zona de afeitado a fondo con etanol al 70%.
- El uso de fórceps romos, tijeras afiladas (o bisturí) ....
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Resultados
La técnica quirúrgica descrita permite un éxito en el aislamiento y la implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en un defecto osteocondral artificial. La configuración experimental dio como resultado una integración con éxito del implante en el cartílago circundante.
El defecto fue ocupado por tejido de reparación con propiedades biomecánicas similares y durabilidad similares en comparación con el cartílago circundante. La fibrina-célula-coágulo se preparó in vitro e.......
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Discusión
En los últimos años, la posibilidad de tratar complejas articulares defectos osteocondrales - tales como las derivadas de la osteocondritis disecante, osteonecrosis y trauma - con los enfoques de ingeniería de tejidos se hizo más y más atractivo. En las entidades patológicas mencionadas anteriormente, daño a los tejidos se extiende al hueso subcondral y consiste en dos tejidos que se caracterizan por diferentes capacidades curativas intrínsecas 1. Hay un creciente interés en el papel del hueso subcondral para.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la Asociación Alemana de Investigación (subvención Excmo 4578/3-1) y en parte por el FP7 de la UE-Proyecto "GAMBA" NMP3-SL-2010 hasta 245.993.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Suero bovino fetal (FCS) | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicilina/Estreptomicina | Biochrom AG | A 2210 | 1.000 unidades/10 μg/μl en NaCl al 0,9% |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Etileno (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Solución de Azul de Tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Solución de separación Biocoll | Biochrom AG | L6115 | Solución isotónica Densidad: 1,077 g/ml |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanilo | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| Solución de NaCl (0,9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Jeringas (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Agujas (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Pinzas (romas/afiladas) | Aesculap | ||
| Tijeras | Aesculap | ||
| Cúteres | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipetas de investigación | Eppendorf | ||
| Cortador de hueso | Aesculap | ||
| Placas de cultivo celular de 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Área de crecimiento 60,1 mm2/147,8 mm2 |
| Frascos de cultivo celular de 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Tubos cónicos (50 ml) | TPP AG | 91050 | Sterilizados por radiación gamma |
| Incubadora de CO2 | Forma Scientific Inc. | ||
| Cabina de flujo laminar para cultivo celular Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Serrucho estéril | Aesculap | ||
| Centrífuga Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocitómetro | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Taladro neumático | Aesculap | ||
| Kit TISSUCOL-1,0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibras (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Vendaje en spray (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable al vapor de agua |
Referencias
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al.
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Reimpresiones y permisos
