Artículo de método

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

DOI:

10.3791/50025

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12 de diciembre de 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

En este artículo

Resumen

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Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la corteza visual primaria de los mamíferos no roedores, las neuronas se agrupan de acuerdo a su preferencia por las características del estímulo como la orientación 1-4, 5-7 dirección dominación, ocular 8,9 y disparidad binocular 9. Selectividad de orientación es la característica más ampliamente estudiado y un mapa continuo con un diseño cuasi-periódico de orientación preferida está presente en toda la corteza visual primaria 10,11. La integración de los aportes sinápticas, celular y de red que conducen a las respuestas de estímulos selectivos en estos mapas funcionales requiere de la hibridación de técnicas de imágenes que abarcan sub-micrón milímetros a escalas espaciales. Con los métodos convencionales de la señal óptica intrínseca, la disposición general de los mapas funcionales a lo largo de toda la superficie de la corteza visual se puede determinar 12. El desarrollo in vivo de dos fotones microscopía utilizando colorantes sensibles al calcio permite a uno determinar la SYNAPTentrada ic llegar a las espinas dendríticas individuales 13 o registro de actividad simultánea de cientos de los distintos órganos de células neuronales 6,14. Por consiguiente, la combinación de imágenes de señal intrínseca con la resolución submicrónica espacial de dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar exactamente qué segmentos dendríticas y células contribuyen a la micro-dominio de cualquier mapa funcional en el neocórtex. Aquí se demuestra un método de alto rendimiento para la rápida obtención de un mapa cortical y orientación dirigida a un microorganismo específico de dominio en este mapa funcional para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en un mamífero no roedora. Con el mismo microscopio usado para dos fotones de formación de imágenes, en primer lugar generar un mapa de orientación utilizando imágenes de señal óptica intrínseca. A continuación, le mostramos cómo dirigir una micro-dominio de interés utilizando una micropipeta cargada de tinte a cualquiera de etiqueta con una población de cuerpos de células neuronales o la etiqueta de una sola neurona de tal manera que las dendritas y los axones, las espinas son visibles envivo. Nuestros criterios de búsqueda sobre los métodos anteriores facilitar el examen de neuronales relaciones estructura-función con la sub-celular resolución en el marco de neocorticales arquitecturas funcionales.

Protocolo

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1. Preparación quirúrgica

  1. Inducir la anestesia y vigilar continuamente la frecuencia cardíaca, terminar tidal CO 2, EEG, y la temperatura. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Médica de Carolina del Sur y se basaron en los que previamente publicada 9,15.
  2. Exponer la superficie dorsal del cráneo por el corte de la piel con una cuchilla de escalpelo. Separe los tejidos conectivos que recubren el hueso utilizando una cureta Brudon. Limpie el hueso utilizando aplicadores con punta de algodón y gasa de algodón. Aplique la cera ósea (según sea necesario) con el cráneo, para detener el sangrado ocasional a través de pequeñas venas emisarias.
  3. Adjuntar una placa de titanio o de acero inoxidable al cráneo (más de la región de interés en el que se realiza la craneotomía) mediante el uso de cemento dental mezclado con pintura de color negro (ver Materiales). Una abertura rectangular en el centro de la placa de cabeza proporciona el acceso para la craneotomía y formación de imágenes ópticas. Adjuntar una cámara de metal en la parte superior de la placa de cabeza. Esta cámara servirá como un depósito de fluido para la formación de imágenes con la lente de objetivo de inmersión en agua.
  4. Fije la placa de cabeza a una etapa xy usando postes de metal.
  5. Thin una gran área del hueso dentro de la abertura rectangular de la placa superior mediante el uso de un taladro dental. El área a ser adelgazada debe extenderse más allá de los límites de la craneotomía planificada. El cráneo grueso de los mamíferos no roedores, se debe diluir si imágenes de alta resolución de ser adquiridos a partir de la neocorteza porque en el sitio de la craneotomía, el espesor del hueso determinará el espesor de la agarosa entre el cubreobjetos y la superficie neocortical (ver más abajo) .
  6. Haga un esquema de 2 x 2 mm cuadrados en el hueso de la craneotomía. Enjuague la cámara periódicamente con fluido nuevo cerebroespinal artificial (ACSF) para eliminar los fragmentos de hueso y minimizar la disipación de calor a la corteza subyacente. Aplicar cera de hueso, según sea necesario, para detener el sangrado ocasional.
  7. Lift el colgajo óseo con un fórceps # 3.
  8. Deje únicamente la capa inferior de la duramadre con una multa fórceps (# 5CO) y tijeras Vannas primavera. La duramadre en mamíferos no roedores es gruesa y opaca, pero se puede quitar en capas distintas. El sangrado es raro pero puede ser detenida con Gelfoam y cualquier residuo de sangre se debe extraer con cuidado la capa restante de duración utilizando fórceps y aclarado con ACSF. La última capa de la duramadre es transparente y los vasos piales debe ser claramente visible a través de ella. De salir de esta última capa de la duramadre intacta durante la formación de imágenes de la señal intrínseca aumentará la tasa de éxito de la carga a granel de indicadores de calcio fluorescente para la fase de formación de imágenes posterior de dos fotones del experimento (véase la discusión).
  9. Aplicar una gota de tibia agarosa al 2% (disuelta en ACSF) e inmediatamente colocar un cubreobjetos sobre la craneotomía. Ver la craneotomía para asegurar que las pulsaciones respiratorias y cardiovasculares son mínimos mediante el uso de un microscopio de disección quirúrgica o los oculares de la de dosmicroscopio de fotones en el campo brillante modo.

2. Intrínseco señal óptica de imagen

  1. Añadir gel-espuma empapado con ACSF alrededor del exterior del cubreobjetos para evitar que la agarosa de secado durante la formación de imágenes de la señal intrínseca.
  2. Fije la señal intrínseca imagen de la cámara CCD para el estándar de montaje C puerto en la parte superior del microscopio de dos fotones (Figura 1). Coloque la fuente de iluminación de luz en la mesa de aire cerca de la etapa de XY (fig. 1A). Coloque y asegure las guías de luz de más de la craneotomía y placa superior / cámara (fig. 1B). Retraer el dicroico primario y el espejo debajo del orificio de montaje C, de modo que la luz reflejada rojo necesaria para señales intrínsecas pasará directamente de la craneotomía a la cámara CCD (Figura 1C-D). Uso del objetivo 4x aire (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm campo de vista está disponible para la imagen de la señal intrínseca.
  3. Insertar un filtro de calor en el light camino para prevenir la corteza de calefacción. El uso de un filtro que deja pasar la luz verde (546 nm centro λ) y grabar una imagen digital de referencia de los vasos sanguíneos superficiales corticales.
  4. Mover el foco z a 500 micras debajo de la superficie cortical. Utilice un filtro rojo (630 nm centro λ) para iluminar la corteza para la medición de señales intrínsecas. Coloque las guías de luz de manera que la superficie cortical está uniformemente iluminado. Proteger la craneotomía de la luz producida por la pantalla estímulo visual. Presentar una secuencia de estímulos visuales y grabar imágenes de reflectancia de datos. Para generar un mapa de orientación dentro de 10 min, recoger datos correspondientes a 4 repeticiones de una secuencia de estímulos 8 (4 orientaciones y direcciones dos para cada orientación).
  5. Analizar los datos de las señales intrínsecas para generar un mapa de color orientación falsa. Selección de regiones objetivo potenciales para dos fotones etiquetado de las neuronas, por ejemplo, la orientación singularidades pinwheel - puntos en el mapa dondetodas las orientaciones preferidas convergen (Figura 2A). Superponer el mapa de orientación y la imagen de la vasculatura superficie cortical (Figura 2B-C). Use la organización de los dominios funcionales y la ubicación de los buques de gran superficie para seleccionar un objetivo, evitando lugares con vasos sanguíneos grandes y arteriolas 15.

3. Bulk Loading Indicadores de calcio fluorescente

  1. Preparar una solución de 20% de Pluronic / DMSO mediante la adición de 1 g de Pluronic en 5 l de DMSO. Calentar la mezcla a 60 º C durante 10 min para disolver completamente el Pluronic. Dejar que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente. Añadir 4 l de la mezcla de Pluronic / DMSO a un vial de 50 mg de indicador de calcio fluorescente Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). A continuación, añadir 1 l de un colorante rojo (Alexa Fluor 594, 2 mM de solución madre) y 35 l de solución de la pipeta (véase Materiales) para una concentración final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicar la solución durante media hora enun baño de agua helada y luego se centrifuga con un filtro de 0,45 micras para eliminar las impurezas.
  2. Tire una pipeta cónica de longitud con un diámetro de la punta exterior de 2.0-2.5 m. Cargar 5 l de la mezcla de colorantes en la pipeta.
  3. Retire la capa final de duración para facilitar la inserción pipeta y obtener la más alta calidad de dos fotones de imágenes.
  4. Determinar la ubicación exacta en la superficie cortical que la pipeta debe ser colocado con el fin de alcanzar su objetivo en la capa cortical 2/3. Nuestro objetivo predeterminado cortical es una singularidad pinwheel en el mapa de orientación (Figura 2). La pipeta debe ser conducido en la corteza en un ángulo de 30 º para pasar entre la pared de la cámara y el objetivo. Por lo tanto, para etiquetar la región diana 200 micras por debajo de la superficie cortical, la posición de entrada de la pipeta en la superficie cortical será de aproximadamente 350 micras laterales a la posición de destino (Figura 3 AB).
  5. Mover la fase XY (en el que el animal y el pmicromanipulador ipette se colocan) para centrar la posición de la superficie cortical entrada en el objetivo (Figura 3C). Utilice un objetivo de 20x o 40x con una distancia de trabajo (WD) de al menos 3 mm (véase Materiales) para asegurarse de que la pipeta entrará fácilmente en la corteza sin tocar el objetivo o el hueso a lo largo de la pared de la craneotomía. Una vez que la posición de entrada se centra en el objetivo, elevar la posición Z del objetivo por 2 mm (Figura 3D). Con la epi-fluorescencia verde semáforo se puso en rojo para visualizar el colorante Alexa en la pipeta, utilizar el eje diagonal de la micromanipulador para mover la pipeta hasta que su punta esté centrada (y centrado) con el objetivo directamente por encima de la posición de la superficie cortical entrada ( Figura 3E).
  6. Bajar la pipeta verticalmente (a lo largo del eje z), hasta que la pipeta llegue a la superficie cortical (Figura 3F), mientras que continua viendo la punta de la pipeta a través de la OCUlars del microscopio. Uso de iluminación de campo brillante, los vasos sanguíneos y la superficie cortical restantes membranas meníngeas (piamadre y aracnoides) son fácilmente visibles como la pipeta se aproxima a la superficie cortical. Si la pipeta no llega a la posición de entrada deseada, elevar la pipeta y recalibrar de focalización basado en los puntos de referencia vasculares en la superficie cortical.
  7. Retire el objetivo, absorbe y expulsa el exceso de líquido cefalorraquídeo de la craneotomía y secar el hueso adyacente usando sin pelusa lanzas de absorción. Aplicar una gota de tibia 3% de agarosa (disuelta en ACSF) para estabilizar la corteza que es visible a través de la craneotomía (Figura 3G). En no roedores, 3% de agarosa es necesario para amortiguar pulsaciones para una utilización eficaz de colorantes fluorescentes por las neuronas. Para las imágenes de la señal óptica intrínseca sólo 2% de agarosa es necesaria porque la combinación de 2% de agarosa y el cubreobjetos proporciona la estabilidad necesaria. Aquí, no cubreobjetos se utiliza para el paso de tinte de carga de modo 3% de agarosa senecesario. Después de que la agarosa se ha solidificado, insertar un objetivo de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) y volver a llenar la cámara con ACSF.
  8. Cambie de campo claro a dos fotones de visión y busque la punta de la pipeta. Usando el eje diagonal de la micromanipulador, mover la pipeta hasta que su punta alcanza la profundidad deseada en la corteza (Figura 3H). Ocasionales ráfagas de expulsión de presión de la mezcla de colorantes (un psi pocos, cada pulso de 0,1 s) le ayudará a evitar que la punta de la pipeta se obstruya. Debido OGB-1 AM sólo se hace visible al entrar en las células, el rojo colorante Alexa es crítica para la visualización de la punta de la pipeta en el interior de la corteza.
  9. Antes de intentar cargar las neuronas en la capa cortical 2/3 con la dosis completa de tinte, re-enfocar el objetivo en la superficie cortical para confirmar la profundidad de la punta de la pipeta y asegurarse de que la punta está en la ubicación de destino basado en la disposición de vasos sanguíneos superficiales. Si la pipeta está en la capa 2/3, pequeñas bocanadas de la mezcla de colorantes debe iluminar laespacio extracelular y revelan un conjunto denso de los cuerpos celulares circulares como sombras oscuras.
  10. Para cargar los cuerpos celulares neuronales en una esfera de diámetro corteza 300-600 micras, inyectar la mezcla de tintes en el espacio extracelular utilizando 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Los pulsos de presión no debe ser tan fuerte que el tejido se mueve. Después de la inyección se ha completado, espere unos pocos minutos, luego retire la pipeta y objetiva. Espere 1 hora para permitir la OGB-1 AM a estar plenamente en marcha por las neuronas.
  11. Eliminar la agarosa utilizado para la carga de colorante y enjuagar la cámara de registro. Ponga una pequeña gota de 2-3% de agarosa en la superficie y poner rápidamente un cubreobjetos sobre la craneotomía. Debido a que los tintes fluorescentes son sensibles a la luz, evitar la sobre-exposición de la corteza de campo brillante o luz epi-fluorescente. Insertar un alto NA (1,0) 20x objetivo en el soporte objetivo y volver a centrar la región cortical etiquetado con arreglo al objetivo con la etapa xy. Proteja la craneotomía de exfuentes traneous luz, por ejemplo, visualización de estímulo visual, utilizando múltiples capas de material apagón.

4. De celda única Electroporación de colorantes fluorescentes

  1. Para el estudio de la morfología dendrítica, preparar una solución de 100 mM de Alexa Fluor 594 (dilución 1:20 en ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Para obtener imágenes funcionales de las dendritas de una sal OGB puede utilizarse 16,17.
  2. Tire una pipeta cónica larga con un tamaño de punta de 1 micras y con carga de 5 l de medio de contraste en la pipeta. Todos los demás pasos de la focalización de un dominio funcional son idénticos al método de carga a granel (Figuras 1-3). Para posicionar la punta de la pipeta adyacente a una membrana celular neuronal cuerpo, controlar el aumento de la impedancia de los electrodos y aplicar presión bocanadas de tinte para iluminar el espacio extracelular y ver los cuerpos celulares como sombras durante dos fotones de imágenes.
  3. Cuando la punta de la pipeta es adyacente a una membrana celular neuronal cuerpo, utiliza el 800A Axoporator para aplicarPulsos de 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). El relleno inmediato de la neurona con colorante se visualiza fácilmente con dos fotones microscopía. Retire la pipeta y recoger imágenes de alta resolución de las dendritas y los axones in vivo.

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Resultados

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Para ilustrar la precisión de los métodos de etiquetado de tinte, nos centramos en las más pequeñas micro-dominio de cualquier mapa que sepa que funciona en el neocórtex no roedor. Escasamente salpicado por todo el mapa de orientación en la corteza visual primaria son singularidades. Esto ocurre en los puntos donde convergen todas las orientaciones preferentes de tal manera que en los mapas de falso color de la orientación preferida, las regiones de todo el aspecto singularidad como "molinillos" (Figura 2A-B).

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Discusión

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Se presenta un método para dirigir el etiquetado de los cuerpos celulares neuronales (o dendritas y axones) en pre-determinados micro-dominios funcionales de la corteza cerebral. La fusión de imágenes de la señal óptica intrínseca con dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar que sinapsis y células contribuyen a la micro-dominio de cualquiera de los mapas funcionales, si correlatos neuronales selectividad con la ubicación de la neurona en un mapa funcional, y el circuito neuronal componentes que cambia...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por becas de la National Eye Institute R01EY017925 y R21EY020985 y financiamiento de las Fundaciones de Dana y Whitehall a PK Agradecemos también a Mateo Petrella para obtener ayuda con los procedimientos quirúrgicos; Grace Dion para rastrear las dendritas se muestra en la Figura 5A, y Pratik Chhatbar para comentarios sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo / material Empresa Número de catálogo Comentarios
1. El soporte de vida / experimento de preparación
El isoflurano Webster Vet NDC 57319-474-05
Vaporizador de isoflurano Midmark VIP 3000
Comentarios manta eléctrica regulada Harvard Apparatus 50-7079F
Del monitor de ECG Digicare Biomédica LifeWindow Lite
Amplificador de EEG Sistemas AM 1800
Monitor de pantalla de EEG Hewlett Packard 78304A
Fin de marea de CO 2 monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimizar la ventilación
Rebabas de metal duro de perforación para la perforación del hueso Henry Schein fino (0,5 mm punta) y gruesa (1,25 mm punta)
Cemento para placa cabezal / cámara Dentsply 675571, 675572
Polvo negro Tempera Paint Sargent Art Inc. 22-7185 Añadir al cemento para mejorar el blindaje de luz y reducir los reflejos
Agarosa - Tipo III-A Sigma A9793 Para minimizar las pulsaciones durante la señal intrínseca y la imagen de dos fotones
Cubreobjetos: 5 o 8 mm de diámetro, 0,17 mm de espesor En World Precisioninstrumentos 502040, 502041 Para minimizar las pulsaciones durante la exploración, el cubreobjetos se puede cortar según sea necesario
Brudon curetas George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Limpieza de superficie del cráneo
Bone cera Ethicon W31G Rápidamente deja de sangrar
Aplicador con punta de algodón Microscopía Electrónica de Ciencias 72308-05 Hueso Limpie y seque la superficie
Dumont # 5CO Pinzas Herramientas Artes Ciencias 11295-20 Agarra capas individuales de duración o pia
Tijeras Vannas Primavera Herramientas Artes Ciencias 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 Para detener la hemorragia en la duramadre
Lanzas de absorción Herramientas Artes Ciencias 18105-01 Absorción ultra rápida y libre de pelusa de CSF
Blackout materiales Thorlabs BK5 Escudo craneotomía
2. Teñir preparación / inyección
Dimetil sulfóxido (DMSO) Sigma D2650
Pluronic Sigma P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcio indicador
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Filtro centrífugo (0,45 micras de tamaño de poro) Millipore UFC30HV00 Para eliminar las impurezas antes de la inyección
Vidrio pipeta extractor Sutter Instruments P97
Vidrio borosilicato filamented capilar (1,5 mm de diámetro exterior) World Precision Instruments 1B150F-4 Pipeta de expulsión Dye
Microloader Eppendorf 5242 956 003 Para cargar un tinte en una pipeta
Micromanipulador Sutter Instruments MP-285 Para posicionar pipeta
Regulador de presión de pulso Parker Hannifin PicoSpritzer III Para la inyección de la presión del colorante
De celda única electroporador Molecular Devices Axoporator 800A Para la electroporación del colorante
3. Intrínseca imaging
Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) Olimpo UPLFLN4X
Intrínseca hardware / software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ software se utiliza para la formación de imágenes episódica
Cámara CCD Adimec Adimec-1000
Fuente de luz Fuente de alimentación KEPCO ATE-15M 15
Fuente de luz Optical Imaging Inc. HAL 100 La intensidad de luz en la superficie cortical es de 3-5 mW
Filtro verde (para una imagen vascular) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (paso de banda de 30 nm) Para la imagen de referencia de la superficie de la vasculatura
Filtro rojo (para la señal intrínseca) Optical Imaging Inc. λ = 630 nm (paso de banda de 30 nm) Para recoger señales intrínsecas
Heat filtro Optical Imaging Inc. KG-1
4. Dos fotones de plataforma / imagen
Dos fotones de microscopio y software Tecnologías de la Prairie Ver Shen et al. 2012 para paso de luz, filtros y potencia del láser
Ti: Sapphire láser Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0,5 NA, 3,5 mm WD) Olimpo UMPLFLN20X 0,5 NA objetivo sólo se utiliza para la alineación de pipeta sobre la craneotomía (no para dos imágenes de fotón)
20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) Olimpo XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) Olimpo LUMPLFLN40X/IR
Air tabla Newport ST-200 Aísla preparación de las vibraciones externas
xy etapa Mike Machine Co. (Attleboro, MA) Sujeto experimental y micromanipulador Sutter colocado en el escenario xy
Recetas
Artificial líquido cefalorraquídeo NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4
Adición de la solución 14 NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4

Referencias

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Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

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