Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Summary

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Abstract

El cáncer de próstata es la forma principal de cánceres entre los hombres en los EE.UU. Mientras que la cirugía conlleva un riesgo significativo de la impotencia y la incontinencia, los enfoques quimioterapéuticos tradicionales no han tenido éxito. La terapia hormonal es efectiva en una etapa temprana, pero a menudo se produce el eventual desarrollo de tumores hormono-refractario. Hemos estado interesados ​​en el desarrollo de terapias dirigidas a la deficiencia metabólica específica de las células tumorales. Recientemente, hemos mostrado que las células de tumor de próstata específicamente carecen de una enzima (argininosuccinato sintasa, o ASS) que participan en la síntesis del aminoácido arginina ^1. Esta condición hace que las células tumorales a ser dependiente de arginina exógena, y se someten a estrés metabólico cuando arginina libre se agota por la arginina deiminasa (ADI) ^1,10. En efecto, hemos demostrado que las células de cáncer de próstata humano CWR22 RV1 mueren eficazmente por ADI con la apoptosis independiente de caspasas y autopha agresivagía (o macroautofagia) ^1,2,3. La autofagia es un proceso evolutivamente conservada que permite a las células para metabolizar las proteínas no deseadas por la descomposición lisosomal durante la hambruna nutricional ^4,5. Aunque los componentes esenciales de esta vía son bien caracterizados ^6,7,8,9, muchos aspectos del mecanismo molecular aún no están claros - en particular, ¿cuál es el papel de la autofagia en la muerte-la respuesta de las células del cáncer de próstata después del tratamiento ADI ? Para abordar esta cuestión, se requiere un método experimental para medir el nivel y el alcance de la respuesta de la autofagia en las células - y puesto que no hay marcadores moleculares conocidos que pueden rastrear con precisión este proceso, se optó por desarrollar un enfoque de imágenes basada en el uso de microscopía de fluorescencia cuantitativa 3D ^11,12.

Usando CWR22Rv1 células específicamente marcados con sondas fluorescentes para autofagosomas y lisosomas, se muestra que las pilas de imágenes 3D adquiridos, ya sea con widefield microscopía de deconvolución (y más tarde, con super-resolución, microscopía estructurada-iluminación) puede capturar claramente las primeras etapas de inducción de la autofagia. Con aplicaciones de análisis de imágenes digitales disponibles en el mercado, podemos obtener fácilmente la información estadística sobre el número autofagosoma y lisosoma, el tamaño, la distribución, y el grado de colocalización de cualquier célula con imagen formada. Esta información nos permite rastrear con precisión el progreso de la autofagia en las células vivas y permite que nuestra investigación continua sobre el papel de la autofagia en la quimioterapia del cáncer.

Protocol

1. Parte 1: Cultivo de células y etiquetado inmuno-fluorescencia

1. Grow CWR22 RV1 células de tumor de próstata humanos en cubreobjetos de vidrio (# 1,5 o 170 m de espesor) colocado en placas de 6 pocillos, con RPMI (Mediatech, VA) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / glutamina.
2. Inducir la autofagia mediante el tratamiento de las muestras seleccionadas con la arginina deiminasa (ADI, 0,3 g / ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA, Fisher Scientific, NH) diluido en PBS; 100 l por cubreobjetos, durante 10 min a TA.
4. Lavar las células 3 veces con 1 ml de HBS / BSA.
5. Permeabilizar las células con 0,05% de saponina (Sigma, MO) en HEPES (HBS) / BSA, 100 l por cubreobjetos, durante 15 min a TA.
6. Antes de inmuno-etiquetado, las muestras de bloques con 2,5% de caseína (Sigma, MO) en HBS / BSA, 100 l por cubreobjetos, para 1 hora a TA.
7. Se incuban las células fijas con anticuerpos primarios diluidos en 2,5% de caseína / HBS / BSA, 100 l por coverslip, O / N a 4 ° C.
8. Lavar las células 3 veces con 1 ml de HBS / BSA.
9. Se incuban las células fijas con anticuerpos secundarios diluidos en 2,5% de caseína / HBS / BSA, 100 l por cubreobjetos, durante 1 hora a TA.
10. Lavar las células 3 veces con 1 ml de HBS / BSA.
11. Monte cubreobjetos preparados en portaobjetos de vidrio regulares con el oro SlowFade o prolongar Gold antifade reactivo (Invitrogen, CA) que contiene 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI).
12. Bordes Seal cubreobjetos con esmalte de uñas. Para obtener los mejores resultados de imagen, dar tiempo (idealmente O / N) para los medios anti-fade penetre a fondo las células.
13. Superficie cubreobjetos limpio con metanol y / o cloroformo.
14. Añadir aceite de inmersión (índice de refracción 1,520 cuando se generan imágenes a 37 ° C, o cuando se generan imágenes 1.516 a TA) a la lente objetivo NA 60X 1,42 (Olympus, Japón).
15. Posición de la corredera en la platina del microscopio y establecer el foco con las células de interés.

2. Parte 2: Preparación de las células para imágenes en vivo

1. Crecer CWR22 RV1 células que expresan fluorescente acoplado a la proteína de la cadena Verde claro 3 (LC3-GFP) en medio de cultivo RPMI que contenía 10% de FBS y 1% de antibióticos en placas de cultivo de 35 mm con fondo de vidrio recubiertos con poli-D-lisina (MatTek, MA). Las células se deben colocaron en placas a una densidad suficiente para facilitar la rápida proliferación, pero no tanto que las células están cubiertas y agrupadas por el tiempo de formación de imágenes.
2. Tratar muestras de células seleccionadas con IDA (0,3 g / ml) en PBS.
3. Aproximadamente 1 hora antes de la imagen, diluir 1,5 l de LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) con 20 ml de RPMI. que contiene 10% de FBS y 1% de antibióticos. Utilice las soluciones que contienen ADI para las muestras seleccionadas. Calentar todos los medios a 37 ° C antes de la adición a la placa de cultivo.
4. Se incuban las células con RPMI que contiene LysoTracker Red DND-99 de 15 a 45 min a 37 ° C.
5. Aproximadamente 30 minutos antes de la proyección de imagen, encienda la caja del medio ambiente WeatherStation y permitir que se equilibre a 37 ° C y 5% CO ₂ (con Humidifaire IED).
6. Lavar las células con PBS y reemplazar los medios de comunicación con el estándar RPMI que contiene sólo el 10% de SFB y el 1% de antibióticos. Añadir IDA a las muestras como se indica.
7. Montaje de 35 mm cubreobjetos de fondo placas de cultivo de adaptador personalizado (Applied Precision, Inc., WA) y la posición en la platina del microscopio. Utilice aceite de inmersión (índice de refracción 1,520) en la lente objetivo de 60X 1,42 NA, y la posición de la placa de cultivo montado en el escenario.

3. Parte 3: Microscopía deconvolución y análisis

El protocolo de esta sección se presupone el uso del microscopio Personal deconvolución DV DeltaVision y asociados suite de aplicaciones SoftWorx (Applied Precision, Inc., WA).

1. Encienda el sistema de microscopio, como estación de trabajo de adquisición y control de instrumentos. Abra la aplicación Resolve3D para inicializar la platina del microscopio y se convierten en la fuente de luz de xenón. Permita 10 minutos para la fuente de luz para calentarse y alcanzar condiciones estables.
2. Añadir ungota de aceite de inmersión (índice de refracción 1,520 para las muestras en vivo a 37 ° C o 1.516 para muestras fijadas a TA) en la lente objetivo NA 60X 1,42, y el centro de la muestra de diapositivas (cara de hoja de la cubierta hacia abajo) sobre la lente del objetivo.
3. El uso de cualquiera de iluminación de campo brillante o externa y el mando de ajuste grueso del enfoque, aumentar lentamente la lente del objetivo hasta que el talón de aceite de inmersión hace contacto con el vidrio de cubierta invertida. (A partir de este punto, la capa celular debe entrar en foco dentro de un par de vueltas de la perilla de ajuste de enfoque fino). Cuando se trabaja con muestras fijadas en los portaobjetos, se recomienda evitar las células dentro o cerca de las áreas con burbujas. Cuando se ve con muestras vivas en el plato de fondo de vidrio, evitar mover la lente objetivo fuera de los límites de la cubreobjetos de vidrio.
4. Autofagosomas pueden ser identificados por eGFP señal (verde). Los lisosomas son identificados por LysoTracker Red (muestra viva) o inmunofluorescencia anti-Lamp1 (muestra fija). Los núcleos celulares se identifican mediante DAPI staining (muestra fija).
5. Seleccione el campo de visión deseado. Idealmente, las células deben exhibir una buena señal fluorescente en todos los canales apropiados, y suficientemente adheridas y se extienden sobre la superficie del cubreobjetos para que los contenidos intracelulares son fáciles de visualizar. Pequeños ajustes en x laterales, Y y Z de enfoque pueden ser controlados por ordenador mediante la interfaz Acquire3D. Conjunto binning a 1x1 o 2x2, dependiendo de campo de visión deseado (más células pueden ser vistos en el campo cuando binning se establece en 2x2).
6. Para una imagen dada a través de la sección media de una célula, establecer los parámetros de exposición (por ejemplo, la potencia de transmisión% y el tiempo de exposición) de tal manera que la intensidad de píxel máximo no exceda 3.000 conteos. Generalmente,% de transmisión debe ajustarse lo más bajo posible, sin aumentar el tiempo de exposición correspondiente más de 1 seg. Repita este procedimiento para cada color de la fluorescencia en ser fotografiado y para cada campo separado de vista de obtener imágenes de la mejor calidad.
7. Establezca la ulímites pper e inferior de la Z-stack, ajustando el foco sólo un poco más de la parte superior e inferior de la muestra de células, respectivamente. El número total de imágenes en un determinado Z-pila por lo tanto será determinado por estos límites y por la separación entre las capas (valor por defecto: 0,2 micras).
8. Para minimizar los artefactos de movimiento durante la adquisición de imágenes, se recomienda ajustar el modo de adquisición de la imagen de "longitud de onda entonces z-stack" para muestras fijas, y "z-stack a continuación la longitud de onda" para las muestras en vivo.
9. Las imágenes de fluorescencia se deconvolved usando SoftWorx (Applied Precision, WA) y después analizados utilizando Volocity (Improvision, ahora Perkin Elmer, MA).

4. Parte 4: Super-resolución, estructurado-iluminación (OMX) Microscopía

El protocolo de esta sección se aplica a la utilización de la OMX Microscopio Iluminación Estructurada (Applied Precision, WA).

1. Encienda la alimentación principal y láseres que desee (410 nm, 488 nm y / o 532 nm). Espere 20 millasn para los rayos láser se térmicamente estabilizado.
2. Añadir aceite de inmersión (índice de refracción de 1,516 muestras fijadas en RT) en la lente objetivo de 60X 1,42 NA. Si se ven burbujas en la gotita de aceite, limpie el objetivo y agregue aceite nuevo.
3. Coloca diapositiva muestra en el escenario y en su caso, deje 10 minutos para que las células se asientan en cubreobjetos.
4. Inicialice el programa de adquisición. Utilice iluminación de fluorescencia para ajustar el enfoque hasta que un contorno afilado de la célula puede ser visto. (Se debe tener cuidado en todo momento para minimizar la exposición de las células a la excitación de fluorescencia, hasta que la adquisición de la imagen real).
5. Una tomografía espiral mosaico se puede adquirir una vista previa de las áreas más grandes de la muestra para seleccionar las células o regiones de interés. Se recomienda el uso de tiempos de exposición cortos (1-10 ms) y de baja potencia de excitación (0,1-1% de transmisión) durante la exploración de la muestra o la búsqueda de objetivos.
6. Identificar autofagosomas por fluorescencia de GFP-LC3. Identificar los lisosomas por Alexa Fluor 555 anti-LÁMPARA(Proteína de membrana asociada a lisosoma) y núcleos de las células usando DAPI (muestras fijos).
7. Elija condiciones experimentales, incluyendo la longitud de onda de excitación, área de la imagen (por ejemplo, 512x512), el grosor de pila, el tiempo de exposición, y el porcentaje de transmisión de láser. Para imágenes súper resuelto, asegúrese de que la opción de iluminación estructurada está habilitada. Para microscopía deconvolución en la OMX, seleccione la opción de iluminación convencional.
8. Para obtener los mejores resultados de la reconstrucción, seleccionar las condiciones experimentales de tal manera que el número máximo de intensidad es de entre 10.000 y 15.000 durante la adquisición. Si fotoblanqueo es una preocupación, se puede usar la imagen en una exposición menor (cuenta entre 5.000 y 10.000). Idealmente, los recuentos no deberían disminuir más de un factor de dos durante toda la adquisición, y disminuye en más de un factor de cuatro deben ser evitados. Si es necesario, reducir el grosor de pila para asegurar un conteo intensidad sostenida. La cámara se satura a 64.000 conteos, lo máximo enintensidad nunca debe superar esto. Para obtener buenas muestras, encontramos las condiciones experimentales para ser 10 ~ 50 ms de tiempo de exposición a la transmisión de láser 1%. Se prefieren las muestras brillantes y fotoestable que se pueden obtener imágenes en varias ocasiones. Se requiere una mancha estable para time-lapse, imágenes súper resueltos.
9. Para reducir el ruido, una velocidad de lectura de 95 MHz (opción de velocidad media) y el tiempo de adquisición de 2 ms o más se recomienda. El aumento de los artefactos se obtienen en la imagen formada reconstruida, cuando la muestra se mueve durante la adquisición. Debido a este efecto, se recomiendan exposiciones cortas para las células no adherentes o de movimiento rápido.
10. Formación de imágenes multicanal se puede realizar de forma simultánea o secuencialmente. Rendimientos modo secuencial menos diafonía y por lo tanto se recomienda.
11. Para reducir photobleaching, en general se recomienda a la imagen con longitudes de onda de excitación más largos primero (532 nm, 488 nm, 410 nm y, a continuación). Sin embargo, para los resultados experimentales mostrados en la Figura 3, esta orden fue inversod (es decir, 48 nm, 532 nm y 410 nm) debido a la fotoestabilidad de esta muestra en particular.
12. Ajuste el límite superior / inferior de la Z-stack moviendo la platina del microscopio hasta que la parte superior / inferior de las células es ligeramente fuera de foco. La distancia deseada entre cada imagen debe mantenerse constante a 0.125 m de súper resolución de imagen, como el software de reconstrucción de tomar este valor como predeterminado.
13. Reconstruir pilas de imágenes utilizando SoftWorx (Applied Precision, WA) y analizar el uso de 6,0 Volocity (Perkin Elmer, MA).

Results

La secuencia de imágenes se muestra en la Figura 1 muestra los cambios físicos que se producen en las células CWR22 durante la primera 80 minutos de la inducción de la autofagia. En este y otros estudios (no se muestra) se observó consistentemente: (1) el desplazamiento del núcleo de distancia desde el centro de la celda; (2) la reducción de los puntos de adhesión focal, y (3) translocación general de autofagosomas y lisosomas hacia el centro de la célula. Además, también se observó un pequeño aumento d...

Discussion

Mientras que la observación directa de las células marcadas con sondas fluorescentes contra LC3 es ampliamente aceptado como un método estándar para confirmar la respuesta autofagia ^6, cuantitativa imágenes en 3D del mismo sistema (como lo hemos hecho) proporciona información y detalles sin precedentes sobre el complejo proceso de autofagia celular . En particular, se observa que cientos (si no miles) de autofagosomas en células vivas se forman dentro de 80 min de la inducción de la autofagia. Del mismo modo,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arginina Deiminasa (ADI)	DesigneRx
HEPES	Sigma	H4034
Caseína	Sigma	C5890
Paraformaldehído	Fisher	4042
Saponina	Sigma	S4521
Alexa anti-ratón 555	Invitrogen	A21422
Alexa anti-conejo 647	Invitrogen	A21244
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
anti-Lamp1	DSHB	H4A3
anti-Cadherin	Cell Signaling	#3195
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936
35 mm placa inferior de vidrio recubierta de poli-d-lisina	MatTek	P35GC-1.5-1.4-C
Nº 1, cubreobjetos de 22 mm	Corning	#2865-22
Portaobjetos de microscopio	Globe Scientific	1324G