Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

Resumen

Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda Ex vivo Cultivadas de embriones de ratón glándulas submandibulares (SMG) con transferencia génica viral se describe. Este método se aprovecha de la capacidad innata de SMG epitelio y el mesénquima para recombinarse espontáneamente después de la separación y la infección de rudimentos epiteliales con vectores adenovirales.

Resumen

La morfogénesis de ramificación se produce durante el desarrollo de muchos órganos, y la glándula submandibular del ratón embrionario (SMG) es un modelo clásico para el estudio de la morfogénesis de ramificación. En la SMG desarrollo, este proceso implica pasos iterativos de brote epitelial y la formación del conducto, en última instancia, para dar lugar a una compleja red ramificada de acinos y conductos, que sirven para producir y modificar / transportar la saliva, respectivamente, en la cavidad oral de ^{1 - 3.} La membrana basal epitelial asociada y los aspectos de la compartimiento mesenquimal, incluyendo las células del mesénquima, factores de crecimiento y la matriz extracelular, producidas por estas células, son críticos para el mecanismo de ramificación, aunque la forma de los acontecimientos celulares y moleculares están coordinados sigue siendo poco conocida ⁴ . El estudio de los mecanismos moleculares de conducción avances epiteliales morfogénesis nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo y da una idea de posible regeneraraproximaciones creativas medicina. Tales estudios se han visto obstaculizados por la falta de métodos eficaces para la manipulación genética del epitelio salival. Actualmente, la transducción adenoviral representa el método más eficaz para atacar a las células epiteliales de las glándulas adultos in vivo ^5. Sin embargo, en los explantes de embriones, mesénquima y densa de la membrana basal que rodea las células epiteliales impide el acceso viral a las células epiteliales. Si el mesénquima se retira, el epitelio puede ser transfectadas utilizando adenovirus, y rudimentos epiteliales puede reanudar la morfogénesis de ramificación en presencia de Matrigel o laminina-111 ^6,7. Mesénquima crecimiento libre de rudimento epitelial también requiere suplementos adicionales con factores de crecimiento solubles y no completamente recapitular la morfogénesis de ramificación ya que se produce en las glándulas intactas ^8. Aquí se describe una técnica que facilita la transducción adenoviral de las células epiteliales y la cultura de la e transfectadaspithelium con mesénquima asociado. Después de la microdisección de los subfusiles embrionarias, la eliminación de la mesénquima, y ​​la infección viral del epitelio con un adenovirus que contiene GFP, se muestra que el epitelio espontáneamente recombina con mesénquima no infectada, recapitulando intacta la estructura glandular SMG y la morfogénesis de ramificación. La población de células epiteliales modificadas genéticamente pueden controlarse fácilmente utilizando métodos estándar de microscopía de fluorescencia, si fluorescentemente etiquetados construcciones adenovirales se utilizan. El método de recombinación de tejidos descrito aquí es actualmente el método más eficaz y accesible para la transfección de células epiteliales con un vector de tipo salvaje o mutante dentro de una construcción de tejido complejo 3D que no requiere la generación de animales transgénicos.

Protocolo

El protocolo contiene cuatro etapas principales, como se representa en la figura 1. Todos los pasos se describen con todo detalle. Construcción de adenovirus y la purificación viral se debe realizar antes de la extracción de órganos para su uso en la transducción genética de diseccionados rudimentos epiteliales. Todos los estándares BSL-2 medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con adenovirus.

1. Embrionarias de ratón glándula submandibular (SMG) Recolección y microdisección

1. Eutanasiar cronometrado embarazadas ratones hembra (cepa consanguínea CD-1 o ICR) utilizando CO ₂ narcosis, segu....

Resultados

El flujo de las etapas experimentales principales se describen en la Figura 1. Un ejemplo de un SMG intacto, un rudimento epitelial aislado, y su mesénquima correspondiente se muestra en la Figura 2. Imágenes de campo claro subfusiles recombinados, que siguen a someterse a la morfogénesis de ramificación cuando cultivadas ex vivo durante los tiempos indicados, se muestran en la Figura 3. Glándulas recombinados cultivadas durante 48 horas epitelial que expresan .......

Discusión

El ex vivo epitelial-mesenquimal técnica de recombinación fue publicado por primera vez por las glándulas salivales submandibulares en 1981 ^16. En este protocolo, se expanda en el método original, usando infección adenoviral para manipular la expresión génica de células epiteliales en el contexto de una glándula recombinado. Se demuestra que un porcentaje de las células epiteliales están infectadas con el adenovirus, mientras que el porcentaje de células que están infectadas depende de las propiedade.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
DMEM / Ham 's F12 medio sin rojo de fenol	Life Technologies	21041-025
Penicilina y Estreptomicina	Life Technologies	15070-163	Valores 10 veces
Dispasa	Life Technologies	17105-041	Congele solo uso alícuotas a -20 º C.
BSA	Sigma	A2934-100G	Fracción V, endotoxinas bajo
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Debe ser alto título (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificados son más eficaces que la columna virus purificados en este ensayo.
16% de paraformaldehído	Ciencias de Microscopía Electrónica	15710	Diluido al 2% en PBS con 5% de sacarosa (w / v)
1X tampón fosfato salino (PBS)	Life Technologies	70011-044	Preparado a partir de valores 10 veces
Solución salina equilibrada de Hank	Life Technologies	14175095	sin calcio, magnesio no, no rojo de fenol
Transferrina	Sigma	T8158	25 mg / ml de solución madre en medio DMEM/F12. Congelar solo uso alícuotas a -20 º C.
L-ácido ascórbico (vitamina C)	Sigma	A4403	75 mg / ml de solución madre en DMEM/F12 media.Freeze solo uso alícuotas a -20 º C.
			Tabla 1. Lista de los reactivos necesarios para SMG protocolo de recombinación.
10 cm de platos de plástico estériles	Corning	430167	Placas de cultivo de tejido no-tratados también se puede utilizar.
Microscopio de disección estéreo con base de luz transmitida	Nikon	SMZ645	Cualquier estéreo microscopio de disección puede ser utilizado que tiene una base de luz transmitida.
35 mm placas de cultivo de tejidos	Halcón	353001	Placas de cultivo de tejido no-tratados también se puede utilizar.
50 mm de diámetro micropocillos platos	MatTek Corporación	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch filtros de membrana	Whatman	110405	13 mm de diámetro, 0,1 mm de tamaño de poro
Widefield microscopio de fluorescencia	Carl Zeiss, EE.UU.	Axio Observer Z1	Cualquier microscopio de fluorescencia (vertical, inverted o estéreo microscopio de disección) se puede utilizar para controlar la expresión de GFP a bajo aumento con una cámara digital conectada.
Microscopio confocal	Leica Microsystems	TCS SP5	La microscopía confocal es necesario ver estructuras detalladas celulares. Cualquier microscopio confocal se puede utilizar.
El tiempo-ratones hembra embarazadas, cepa CD-1 o ICR	Charles River Labs		Los embriones se recogieron en el día 13 (día de descubrimiento con enchufe designado como día 0).
Hoja de bisturí # 11	Herramientas Artes Ciencias	10011-00
Mango de bisturí n º 3	Herramientas Artes Ciencias	10003-12
Dumont # 5 pinzas inox aleación, 0.05mm 0.02mm X	Herramientas Artes Ciencias	11252-20	Ideal para la recolección de glándulas a partir de embriones
Dumont # 5 fórceps dumostar aleación, 0.05mm 0.01mm X	Herramientas Artes Ciencias	11295-20	Puntas finas son necesarias para la eliminación de mesénquima de epitelio. Agujas de tungsteno también se puede utilizar.
			Tabla 2. Equipos utilizados en SMG protocolo de recombinación.