El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.
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Artículo de método
Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia
En este artículo
Resumen
Resumen
Mientras que los estudios clínicos han establecido que las vacunas de DC cargadas con antígeno son seguros y prometedora terapia para los tumores 1, su eficacia clínica queda por establecer. El método descrito a continuación, preparado de conformidad con las Buenas Proceso de Fabricación (GMP) directrices, es una optimización del procedimiento de preparación ex vivo más común para la generación de un gran número de países en desarrollo para los estudios clínicos 2.
Nuestro método utiliza el TLR 3 agonista sintético poliinosínico-policitidílico Carboximetilcelulosa-ácido poli-L-lisina (poli-ICLC) para estimular los países en desarrollo. Nuestro estudio anterior estableció que poli-ICLC es el más potente estímulo de maduración individual para países en desarrollo humano según lo evaluado por una regulación positiva de CD83 y CD86, la inducción de la interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma inducida proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), y los interferones tipo I (IFN), y la interleucina mínima 10 (IL-10) de producción. Países en desarrollo se diferencian a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs congeladas) obtenidos por leucoféresis. PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y se congelaron en alícuotas. En el Día 1, las PBMC se descongelan y se sembraron en matraces de cultivo tisular para seleccionar para los monocitos que se adhieren a la superficie de plástico después de 1-2 horas de incubación a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido. Después de la incubación, los linfocitos se eliminan mediante lavado y los monocitos adherentes se cultivaron durante 5 días en presencia de interleucina-4 (IL-4) y el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) para diferenciar a los DC inmaduras. En el día 6, las DC inmaduras son pulsadas con la proteína hemocianina de lapa californiana (KLH), que sirve como control para la calidad de la vacuna y puede aumentar la inmunogenicidad de la vacuna 3. Los países en desarrollo son estimulados a madurar, cargados de antígenos de péptido, y se incubaron durante la noche. En el día 7, las células se lavaron, y se congelaron en alícuotas de 1 ml que contienen4-20 x 10 6 células usando un congelador de velocidad controlada. Pruebas de liberación del lote para los lotes de centros de datos se lleva a cabo y debe cumplir con las especificaciones mínimas antes de ser inyectadas en pacientes.
Protocolo
1. El aislamiento y la criopreservación de PBMC 4
- Asépticamente pico de uno de los puertos de acceso en la bolsa de leucaféresis utilizando un conjunto de transferencia de plasma. Usando una jeringa de 60 ml, transferir la aféresis obtenidos de pacientes en un frasco estéril de 500 ml.
- Ajustar el volumen de la leucaféresis a 2x su volumen original utilizando medio RPMI a temperatura ambiente. Mezclar bien.
- Mezcle suavemente la botella de Ficoll-Paque PLUS. Añadir 12 ml de Ficoll-Paque PLUS en el tubo cónico estéril de 50 ml.
- Suavemente capa de 30 ml del producto leucaféresis diluido a cada tubo cónico estéril de 50 ....
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Resultados
Entre el 10 - 20% de PBMCs de partida se diferencian en países en desarrollo al final del periodo de cultivo. DC maduras son CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, y CCR7 + (Figura 1). Ellos expresan altos niveles de MHC de clase I y II y las moléculas de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Poli-ICLC también indujo niveles más bajos de PDL-1 en comparación con otros agonistas de TLR 14. Además, estos poli-IC-DCs maduradas segregan grandes cantidades de IL-12 (Figura 2 y 15,1.......
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Discusión
Fase I y II de los ensayos clínicos de los DC derivadas de monocitos he demostrado que inducen la respuesta inmune en los pacientes sin embargo el éxito clínico ha sido limitado 1. Esto puede deberse en parte a la falta de consenso sobre la forma de generar los países en desarrollo óptimos para el uso de inmunoterapia tumoral. Aunque hay numerosas maneras de generar los DC de grado clínico, estos métodos varían en términos de la utilización de citoquinas usados para diferenciar los monocitos, los estímulos .......
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Divulgaciones
Los autores han recibido apoyo financiero de las siguientes opciones: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 y AI084578 K08 (Miller)), la Fundación Bill y Melinda Gates, la Fundación Doris Duke Charitable, Instituto de Investigación del Cáncer, la Alianza para la Investigación de Lupus y la Esmeralda Fundación. Nina Bhardwaj es un co-inventor de patentes relacionadas con la preparación y el uso de células dendríticas para manipular la inmunidad. Los autores no tienen otras relaciones relevantes o de activos financieros con ninguna organización o entidad que tenga un interés financiero en o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito, aparte de los descritos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Andrés Salazar (Oncovir, Inc.) por el don de la poli-ICLC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 medio con L-glutamina | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M solución salina tamponada HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Albúmina humana, solución al 25% USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Suero AB humano | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Solución salina estéril USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 cm² EasyFlask | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1,8 ml Viales CryoTube | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Congelador de velocidad controlada | Thermo | CryoMed |
Referencias
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy
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