Summary
Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.
Abstract
Niet-virale gen-levering met gebruik van polymere nanodeeltjes heeft zich ontpopt als een aantrekkelijke aanpak voor gentherapie voor de behandeling van genetische ziekten 1 en als een technologie voor regeneratieve geneeskunde 2. In tegenstelling tot virussen die aanzienlijke veiligheidsproblemen hebben, kunnen polymère nanodeeltjes worden ontworpen als zijnde niet-toxisch, niet-immunogeen, niet-mutageen, gemakkelijker te synthetiseren, chemisch veelzijdig, die in staat groter nucleïnezuur lading en biologisch afbreekbare en / of ecologisch reageren. Kationische polymeren zelf-assembleren met negatief geladen DNA via elektrostatische interactie complexen in de orde van 100 nm die vaak worden genoemd polymère nanodeeltjes vormen. Voorbeelden van biomaterialen gebruikt nanoschaal polykationische genafgifte nanodeeltjes vormen omvatten polylysine, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s en polyethyleenimine (PEI), een niet-afbreekbare off-the-shelf kationische polymeer gebruikt voor nucleïnezuurafleverende 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) zijn een nieuwe klasse van kationische polymeren die hydrolytisch 4 afbreekbaar 5,6 en zijn effectief gebleken bij genoverdracht naar moeilijk te transfecteren celtypes zoals humane endotheelcellen retinale (HRECs) 7, muizen mammaire epitheelcellen 8, menselijk hersenkankercellen 9 en macrovasculaire (humane navelstreng, HUVECs) endotheelcellen 10.
Een nieuw protocol bij polymere nanodeeltjes gebruik te maken van nanodeeltjes tracking analyse (NTA) te karakteriseren wordt beschreven. In deze benadering worden zowel de deeltjesgrootteverdeling en de verdeling van het aantal plasmiden per deeltje verkregen 11. Daarnaast wordt een high-throughput 96-well plaat transfectie assay voor snelle screening van de transfectie efficiëntie van polymeer nanodeeltjes gepresenteerd. In dit protocol, poly (beta-amino ester) s (PBAEs) worden gebruikt als model polymeren en menselijke retinale endotheelcellen (HRECs) worden gebruikt als model menselijke cellen. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk polymeer nanodeeltjes en elk celtype plaats in een multi-well plaat formaat evalueren.
Introduction
De bepaling van het aantal plasmiden gecomplexeerd per nanodeeltjes belangrijk te ontwerpen effectieve nanodeeltjes gebaseerde gentherapie strategieën, vooral voor co-levering van meerdere plasmiden in dezelfde cel doel, zoals vaak vereist in stamcellen herprogrammering studies 12. Verschillende manieren om het aantal plasmiden geassocieerd met een nanodeeltje bepalen zijn beschreven, en elke benadering heeft nadelen in de technieken voor schatting 13-16. Quantum dot (QD) labeling gecombineerd met TEM wordt gebruikt om plasmiden per deeltje schatten chitosan gebaseerde nanopartikels. Deze schatting QD techniek gecompliceerd door de noodzaak om de DNA dat daarvan kunnen veranderen zelfassemblage labelen, de mogelijkheid dat ingekapselde ongelabelde DNA niet direct gedetecteerd; mogelijke overlap plasmiden en QDs in de 2D TEM beelden van deeltjes en andere vereenvoudigende veronderstellingen 13. Een alternatieve benadering is dat eenpplicable besteld microdomeinen aanwezig in de deeltjes is gebruikt om Lipopolyamine-DNA complexen via cryo-transmissie-elektronenmicroscopie (cryo-TEM), X-ray scattering en dynamische lichtverstrooiing (DLS) 14,15 bestuderen. Helaas materialen zoals de polymere nanodeeltjes hier onderzochte niet van toepassing bij deze methode. . In een andere studie, Collins et al gebruikt een stroom deeltjes beeldanalysetechniek bestuderen (Lys) 16 bevattend peptide / DNA complexen, maar de methode kan alleen beoordelen grotere micron-deeltjes 16. Zo hebben we onlangs een nieuwe en flexibele bepaling van het aantal plasmiden nanodeeltjes 11 kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cel Zaaien
- Sta niet toe dat cellen om te groeien naar overconfluency. Gebruik vroege passage cellen als transfecteren primaire cellen.
- Vierentwintig uur voor transfectie, trypsinize de cellen telt de cellen met een hemocytometer en verdunnen celsuspensie met media op de gewenste celdichtheid (cellen / volume) te bereiken. Zaad cellen in weefselkweek heldere behandelde vlakke bodem 96-well platen met een reservoir en multichannel pipetten. De gekozen dichtheid moet geven 70-80% confluentie op de dag van transfectie. Bijvoorbeeld, zoals weergegeven in Tabel 1, werden de cellen verdund 25 tot 50 cellen / ul voor de transfectie data hier.
2. Celtransfectie
- Verdunning van polymeer en DNA voorraden. Ontdooien polymeer en DNA stock oplossingen bij kamertemperatuur (RT). Verdun polymeer stock oplossing en DNA stock oplossing afzonderlijk in heldere 96-well platen met twaalf kanaalspipetMet het geschikte oplosmiddel concentraties om de gewenste polymeergewicht verkrijgen DNA gewichtsverhoudingen (gew / gew). In dit geval is de gekozen oplosmiddel 25 mM natriumacetaat buffer (pH = 5,2).
- DNA verdunning. Typisch wordt DNA opgeslagen bij 1 mg / ml verdund in natriumacetaat buffer tot een concentratie van 0,03 tot 0,06 mg / ml in een duidelijke niet-weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes (een goed voor een formulering). Tabel 2 toont de typische DNA verdunning protocol voor een formulering van vier duplo-putjes transfecteren in een plaat met 96 putjes geënt met cellen uit stap 1.
- Polymer verdunning. De 100 mg / ml polymeer / DMSO oplossing verdund in natriumacetaatbuffer afhankelijk van de concentratie vereist om het gewenste polymeer te verkrijgen DNA wt / wt verhouding. Het bereik van wt / wt verhouding typisch gebruikt voor genafgifte met poly (beta-amino ester) s (PBAEs) is 20 tot 100. PBAE polymeren worden eerst verdund tot 10 mg / ml, gevolgd door verdunning pROTOCOL zoals getoond in Tabel 3. Het polymeer verdunningen worden uitgevoerd in een duidelijke niet-weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes die het monster oriëntatie van de DNA verdunning gegevensplaatje.
- Nanodeeltjes de vorming. Voeg PBAE oplossing een gelijk volume van het plasmide DNA oplossing met een twaalf kanaalspipet en meng grondig. Laat het mengsel geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 min om zelfassemblage maken.
- Nanodeeltjes transfectie. Na zelf-assemblage worden 20 ul per putje nanodeeltjes toegevoegd aan het kweekmedium druppelsgewijs met de twaalf-kanaal pipet. Herhalingsputjes onbehandeld of getransfecteerd met commercieel verkrijgbare reagentia als controles. De getransfecteerde cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende twee tot vier uur en de putjes worden vervangen door vers medium (100 ul / putje). De keuze van de incubatietijd afhankelijk van de cellijn, kweekomstandigheden en transfectiesysteem. Het verschil in transfectieefficiency en celtoxiciteit als gevolg van verschillende incubatieperiode worden gekwantificeerd door de analyse protocol beschreven in stap 3.
3. Analyse van transfectie-efficiëntie en toxiciteit Cell
Transfectie-efficiëntie wordt visueel onderzocht met een fluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd met een flow cytometer achtenveertig uur na transfectie. Celtoxiciteit wordt visueel onderzocht met een fluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd met behulp van de CellTiter 96 Aqueous One assay vierentwintig uur na transfectie.
- Fluorescentiemicroscopie. Visueel analyseren de putjes voor de expressie van de getransfecteerde reportergen (bijvoorbeeld EGFP of DsRed) met de juiste fluorescentiekanaal. Verwerven beelden voor elke wel, kiezen gezichtsveld dat geschikt vertegenwoordigen de transfectie-efficiëntie voor het betreffende formuleringen (figuur 1). Maak een notitie van een van de cellen toxiciteit visueel waargenomen.
- Flowcytometrie.
- Gebruik meerkanaalspipetten de 96-well plaat bereiden voor flowcytometrie. Wassen met PBS, trypsinize met 30 ul / putje van trypsine / EDTA, neutraliseren met 170 pi FACS buffer (PBS + 2% FBS), pipet op en neer in elk putje, waaronder ongeveer randen en het volledige door 200 ui volume van elk putje in overeenkomstige putjes met ronde bodem of V-bodem 96-well plaat.
- Centrifugeer de plaat bij 130 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder 170 pi medium van elk putje en pipet te mengen cellen met vermijding bellen. Het gebruik van een levensvatbaarheid vlek zoals propidiumjodide (PI), voeg 10 ul FACS buffer + PI (50:1 FACS buffer: PI verdunning; PI stock concentratie 1 mg / ml) in elk putje. Plaats onmiddellijk op ijs en dek tegen licht.
- Start de C6 Accuri flowcytometer, de HyperCyt 96-well gehechtheid, en de HyperView software. Gebruik HyperView Ontwerp en Protocol tabbladen om de juiste p kiezenlaat type, plaat lay-out en andere instellingen, zoals trillen / sip / spoelen / schudden tijd. Om bovenstaande protocol werden de volgende parameters gebruikt, een pre-plate prime een minuut, en een pre-plate schudden gedurende 30 seconden bij 2400 rpm. Sip tijd werd gedurende 15 sec bij 15 tpm, een sonde goed spoelen om de 2 sec, en een inter-en om de 12 putten voor 12 sec schudden bij 2.400 tpm. De inter-schud is belangrijk om de cellen verspreid in de media en een betere mogelijkheid om de gegevens te verwerken zoals geregistreerd door pauzes tussen groepen wells (in dit geval 12 sec).
- Gebruik HyperView Well Identification tab om de gegevens en gescheiden in de juiste put (figuur 2) te verwerken. Om de individuele putjes identificeren, kan het helpen om de software ruisfilter, alsmede met een basisstation nog filter onder de geavanceerde instellingen.
- Kwantificeer percentage van positief getransfecteerde levende cellen van passende gating aan verschillende pop scheidenvraagd (figuur 3). Eerst bekijken de stroom van gegevens op een FSC vs SSC spreidingsdiagram om afzonderlijke cellen van vuil (Figuur 3A). Als propidium jodide (PI) werd gebruikt, de individuele gate celpopulatie en mening dat gegevens op een FSC vs FL3 plot om levende cellen te scheiden van dode cellen en de gate levende cellen. Om het aantal getransfecteerde cellen kwantificeren de live celpopulatie op de geëigende kanalen bijvoorbeeld GFP zichtbaar in FL1. Met de onbehandelde populatie, de onbehandelde cellen gate om het achtergrondsignaal (Figuur 3B) identificeren. De positief getransfecteerde cellen worden geïsoleerd met behulp van deze poort en door het bekijken van de getransfecteerde populaties met zowel scatter en contourlijncurves (figuur 3C en 3D). Er kan een continuüm van positief getransfecteerde cellen, zoals verschillende cellen worden getransfecteerd met verschillende graden van fluorescentie.
- CellTiter 96 Aqueous One assay
- Transfecteren andere plaat op dezelfde wijze voor celtoxiciteit metingen.
- Premix 1 ml van de CellTiter 96 Een waterige testoplossing met 10 ml vers medium. Verwijder het afdrukmateriaal uit cellen en het gebruik van een meerkanaalspipet tot 110 ul van de voorgemengde oplossing + media per well toe te voegen.
- Meet de absorptie bij 490 nm elk uur interval 1-4 uur totdat de absorptie uit de put met onbehandelde toestand in het lineaire gebied van de assay. Bestaan uit vier controleputjes met enige oplossing + media voor een achtergrond absorptie lezen.
- Gemiddelde van de absorptiewaarden van de vier duplo-putjes per staat en aftrekken van de gemiddelde absorptie van elke achtergrond gemiddelde. Normaliseren gecorrigeerde gemiddelde voor elke behandelde aandoening de gecorrigeerde gemiddelde van de onbehandelde toestand om het percentage cellevensvatbaarheid te bepalen.
- Prime het fluidics systeem van de NanoSight NS500 door het uitvoeren van het verdunningsmiddel pomp naar voren op ongeveer 1/5de van de max. snelheid en het monster pomp naar achteren op ongeveer 1/10e van de max. snelheid. Ga door tot het fluidics systeem wordt gespoeld met verdunningsmiddel.
- Bereid de nanodeeltjes te analyseren. Bij PBAEs afzonderlijk verdunnen stock plasmide DNA (1 mg / ml) en stock PBAE (100 mg / ml) in natrium acetaat buffer (25 mM, pH 5) in Eppendorf buisjes.
- Verdun het plasmide DNA concentratie tot 0,06 mg / ml. Polymeerconcentratie kan variëren afhankelijk van het gewenste gewicht gewicht verhouding van polymeer tot DNA (bijvoorbeeld voor 60 gew / gew deeltjes wordt polymeer verdund tot 3,6 mg / ml).
- Voeg de polymeeroplossing een gelijk volume van het plasmide DNA oplossing toe en meng grondig. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 min om zelfassemblage maken.
- Dilute de nanodeeltjes oplossing 100-voudig in PBS zodat de nanodeeltjes concentratie in het juiste bereik voor NTA en tot een uiteindelijk volume van ten minste 500 pi verkrijgen.
- Plaats het monster in de NanoSight Door de laadbuis in de sample Eppendorf buis (Figuur 4A). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen te introduceren.
- In de opnamemodus, verhoogt u de camera-niveau totdat de deeltjes kan worden gezien. Scherpstellen zodat de deeltjes glad uitzien (figuur 4A en 4B).
- Terwijl in de standaard modus, past de camera-niveau voorbij het punt dat alle deeltjes te zien op het scherm. Verlaag de camera niveau het laagste niveau dat de deeltjes allemaal nog worden waargenomen. Als een intermediair camera niveau nodig is, gaat u naar de geavanceerde modus en wijzig de sluiter van de camera en krijgen om de juiste niveaus.
- Visueel controleren om ervoor te zorgen dat er tussen 20 - 100 deeltjes op de screen. Een ideale aantal voor de nanodeeltjes tracking is ongeveer 50 deeltjes. Als er te veel of te weinig, spoel de NS500, pas dan de verdunning in PBS, en opnieuw laden van het monster.
- Stel de opname duur volgens de standaard modus tafel. Meestal 30 - 60 sec een geschikte capture lengte (Figuur 4B).
- Om de volgende sample te laden, spoel het systeem, vervolgens opnieuw laden van de nieuwe monster.
- Zodra video's worden vastgelegd, ga dan naar de verwerkende fase door het openen van een videobestand.
- Er zijn een aantal parameters die kunnen worden afgestemd om optimaal verwerken video (Figuur 4C). Het doel is om parameters te selecteren die het best elk deeltje op het scherm, zoals aangegeven door een rood kruis op het scherm van elk deeltje (figuur 5) vast te leggen.
- Verhoog het scherm krijgen om beter te zien de deeltjes. Onder de standaard of geavanceerde modus, selecteert u de auto voor de parameters aan te passen door ClickIng de daarvoor bestemde vakken. In het geval dat de automatische instellingen niet voldoende deeltjes te selecteren, unclick de doos en handmatig instellen van de parameters (Figuur 4C).
- Zodra alle deeltjes worden geplukt op het scherm, klikt u op de knop proces van de software om het videobestand (Figuur 4C) te verwerken. Dit geeft de deeltjesgrootteverdeling, maat gemiddelden, en deeltjesconcentratie.
- Om te zorgen dat de deeltjes concentratie nauwkeurig is, wijzigt u de PBS verdunning, zoals door het verhogen van verdunning door 2x, en herhaal de bovenstaande procedure. Meten meerdere verdunningen van hetzelfde monster wordt aanbevolen dat de meting van de concentratie van het monster nauwkeurig is. Een goed aanbod voor de meting is 10 7 -10 9 deeltjes / ml.
- Controleer of alle plasmiden worden opgenomen in nanodeeltjes door het uitvoeren van gelelektroforese van de nanodeeltjes en het beoordelen of een vrije DNA aanwezig is.Indien niet alle plasmiden zijn ingekapseld, gebruik maken van standaard technieken om DNA-absorptie te meten om de totale ingekapselde plasmiden kwantificeren.
- Het gemiddelde aantal plasmiden per deeltje berekenen, deelt het totale ingekapselde plasmideconcentratie de NTA gemeten deeltjesconcentratie. Om de plasmide per deeltje monsterverdeling schatten dmv de NTA deeltjesgrootte histogram de volumefractie van elk 1 nm bin deeltje berekenen. Vermenigvuldigen volumefractie verdeling van de totale hoeveelheid plasmide het aantal plasmiden te verkrijgen in elke bin. Verdeel deze nummers het aantal deeltjes in elke bin het aantal plasmiden per deeltje te verkrijgen voor elke deeltjesgrootte (Figuur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 een fluorescentiemicroscopie beeld van een voorbeeld van een succesvolle transfectie van HRECs de EGFP plasmide. De helder veldbeeld is nuttig om te waarborgen dat cellen hun normale morfologie te behouden. Bovendien kan cellevensvatbaarheidsassays, zoals MTS of vergelijkbare testen worden gebruikt om de toxiciteit nanodeeltjes 7 beoordelen. Flowcytometrie, zoals beschreven, kan worden gebruikt om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren. Bij gebruik van de HyperCyt multi-well plaat bevestiging, zal de data moeten op passende wijze worden verwerkt om correct identificeren van de bronnen. Zoals te zien in het rechterpaneel van figuur 2, wanneer de cellen goed (duizenden cellen per putje), en de fluidics goed werken, de afzonderlijke putjes gemakkelijker uitzoeken zowel handmatig als door de software. Indien echter de cellen te laag of er een probleem met het fluidics, wordt het veel moeilijker om de indivi identificerenhandmatige wells (linker paneel van figuur 2), en het experiment moet waarschijnlijk worden herhaald. Vervangen van het slangetje van de Hypercyt kan vaak problemen oplossen met het monster stroom. Zodra het individu en worden verkregen, kunnen meest flowcytometrie software worden gebruikt om de uitgevoerd. FCS te analyseren. In figuur 3 is FlowJo gebruikt om de gate positief getransfecteerde cellen door vergelijking met de onbehandelde wells.
De PBAE nanodeeltjes meestal tussen 100 - 200 nm in grootte gemeten door de NanoSight NTA. Bij het uitvoeren NTA is het belangrijk dat het aantal nanodeeltjes op het scherm tussen 20 -. 100 komt de software kunnen nauwkeurig volgen de deeltjes Figuur 5A is een voorbeeld van te veel deeltjes, terwijl figuur 5B toont een voorbeeld van een passend aantal. Verwerken van de vastgelegde video moet gebeuren De waargenomen deeltjes scherm worden opgevangen door de softwar e, vertegenwoordigd met het rode dradenkruis. Een voorbeeld van wanneer de drempel voor het opnemen van deeltjes te laag kan worden gezien in figuur 5C, terwijl een voorbeeld van een betere drempelniveau wordt gezien in figuur 5D. Een andere verdunning van het monster kan worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het monster in de juiste concentratiebereik. De nieuwe deeltjesconcentratie gegeven door de NanoSight moet overeenkomen met de nieuwe verdunning. Zodra de grootte en deeltjesconcentratie worden verkregen, kan het plasmide per deeltje gemiddeld en verdeling berekend. Voorbeeld resultaten zijn te zien in figuur 6. De experimentele tijdlijn is weergegeven in figuur 7.
| Wells / Plaat | Volume / Well (pl) | Cellen / putje |
| 96 | 100 | 2.500 tot 5.000 |
| Wells / Plaat | Volume / Well (pl) | Deeltje Volume / Well (pl) | DNA / Well (ug) | DNA (ug / ul) | DNA 1 pg / pl stock (pl) | NaAc (pl) |
| 96 | 100 | 20 | 0,6 | 0,06 | 3 | 47 |
Tabel 2. Typische DNA verdunning protocol voor een 96-well plaat formaat.
| Polymeer: DNA (wt / wt) | Deeltje Volume / Well (pl) | # Repliceren Wells | DNA / Well(Pg) | Polymeer / Well (ug) | Polymer / 10 ug / ul voorraad (ui) | NaAc (pl) |
| 20 | 20 | 4 | 0,6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0,6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0,6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0,6 | 60 | 30 | 20 |
Tabel 3. Typische polymere verdunning protocol voor een 96-well plaat formaat.
Figuur1. Single kleurkanaal fluorescentie beeldvorming van HRECs getransfecteerd met PBAE (links) GFP-fluorescentie, groen gekleurd;. (Midden) Helderveld beeld; (Rechts) Composiet beeld.
Figuur 2. Hypercyt software goed identificatie stap na verzamelde gegevens (links) Voorbeeld van problematische gegevens als gevolg van lage aantallen of probleem met het fluidics,.. (Rechts) Voorbeeld van schone data, met gemakkelijk te herkennen putten Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. FlowJo gating op cellen getransfecteerd met plasmide EGFP (A) FSC vs SSC onbehandelde cellen. (B) FL1 versus FL3 for untreated cellen (C, D) FL1 versus FL3 voor cellen getransfecteerd met PBAE. Beide pseudo-kleuren dichtheid (C) en (D) contourplots zijn nuttig om de locatie te poorten te tekenen bepalen.
Figuur 4. Screenshot van delen van de NanoSight nanodeeltjes het bijhouden van analyse software, versie 2.2 (A) De vloeistofcomponenten controle;. (B) de opnamefunctie, wordt gebruikt om video van de nanodeeltjes vast te leggen; (c) de verwerking modus beschikbaar na het openen van een eerder opgenomen video. Rode vakjes hoogtepunt functies besproken in het protocol. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. . Voorbeeld van NanoSight video-opname en analyse Screenshots van het monster vóór video-opname voor het monster dat niet genoeg is verdund (A), en met de juiste verdunning (B); Screenshots van analyse-modus met deeltjes detectiedrempel te laag zijn (C) en stel de juiste (D), met rood dradenkruis het identificeren van alle deeltjes op de juiste wijze. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 6. Grootteverdeling en plasmide per korrelverdeling data van PBAE (B5S3E7, 60:1 polymeer DNA wt / wt) gebaseerde nanopartikels geanalyseerd met NanoSight tracking analyse techniek. Herdruk van [14] Klein, 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez ,J., en Groen, JJ Een nieuwe test voor het kwantificeren van het aantal plasmiden ingekapseld door polymeer nanodeeltjes, 367 tot 373, Copyright 2012, met toestemming van Wiley-VCH. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 7. Experimentele tijdlijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protocollen hierboven beschreven methoden voor de transfectie efficiëntie van nanodeeltjes formuleringen, alsmede een manier om de deeltjesgrootte en DNA laden van de nanodeeltjes te karakteriseren. Het aantal plasmiden per deeltje is een belangrijke parameter die kan helpen bij het voorspellen van de effectiviteit van het deeltje en kan ook worden gebruikt voor dosisbepaling. Nanodeeltjes tracking analyse kan worden uitgevoerd in een aantal verschillende waterige oplossingen, zoals verschillen in zoutconcentratie. Vaak karakterisering uitgevoerd in PBS tot fysiologische zoutoplossing bootsen. Terwijl dimensionering in PBS een goede schatting van de grootte van de nanodeeltjes in media of fysiologische zoutoplossing te geven, kan de hoeveelheid serum aanwezige het formaat en de stabiliteit van nanodeeltjes 17. Daarom kunnen deeltjes karakterisering in verschillende concentraties serum belangrijk zijn voor bepaalde toepassingen. Om de deeltjes te karakteriseren in serum, een additiointerne stap wordt aanbevolen door de hoge achtergrond verstrooiing van serumeiwitten. In dit geval moet de deeltjes fluorescent gelabeld worden, zodat door het gebruik van de fluorescentie filter, de deeltjes duidelijk specifiek kan worden gevolgd vanaf serumeiwitten.
Het plasmide per deeltje kwantificering algemeen zijn voor gebruik met verschillende nanodeeltjes formuleringen, andere polymère of anorganische deeltjes systemen. Vanwege de verschillende lichtverstrooiing gedrag van verschillende materialen, de video-opname-en verwerkingsparameters kan moeten worden aangepast. Bovendien kan de gevoeligheid van de NTA veranderen afhankelijk van het materiaal. Het plasmide per deeltje hierboven beschreven protocol is een snelle en handige methode voor het karakteriseren van nanodeeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs danken de TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) en NIH R21CA152473 voor ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
