Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Summary

Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

Abstract

Tecnologías de células de patrones que son rápidos, fáciles de usar y asequible se requiere para el desarrollo futuro de los ensayos de rendimiento de alta celulares, plataformas para el estudio de interacciones célula-célula y sistemas de ingeniería tisular. Este protocolo detallado se describe un método para la generación de co-cultivos de células utilizando soluciones biocompatibles de dextrano (DEX) y polietilenglicol (PEG) que los de fase separada cuando se combina encima de las concentraciones umbral. Las células se pueden modelar en una variedad de configuraciones que utilizan este método. Patrón célula exclusión se puede realizar mediante la impresión de gotitas de DEX sobre un sustrato y cubriéndolos con una solución de PEG que contienen células. La tensión interfacial formada entre la dos soluciones de polímero hace que las células estén en torno al exterior de la gotita de DEX y formar un claro circular que puede ser utilizado para los ensayos de migración. Islas de células puede ser modelado por dispensación de una fase rica en células DEX en una solución de PEG, o cubriendo la DEXgota con una solución de PEG. Co-cultivos se pueden formar directamente mediante la combinación de exclusión celular con DEX patrón isla. Estos métodos son compatibles con una variedad de enfoques de manejo de líquidos, incluyendo micropipeteo manual, y se puede usar con prácticamente cualquier tipo de célula adherente.

Introduction

Acuosos sistemas de dos fases (ATPSs) forma cuando las soluciones de dos polímeros incompatibles se mezclan juntos en concentraciones suficientemente altas. La separación de fases está influenciada por una variedad de factores que incluyen el peso molecular y la polaridad de los polímeros, la temperatura de las soluciones, pH y contenido iónico del disolvente acuoso ^{1, 2.} El punto en el que las dos soluciones de polímeros separados se determina por las propiedades fisicoquímicas de la fase del sistema elegido, pero en general se produce a bajas concentraciones de polímero (menos de 20% peso / peso) bajo condiciones no desnaturalizantes, permitiendo ATPSs que se utilizará para la biotecnología ^3-9 aplicaciones.

Con mucho, los más ampliamente estudiados ATPS es el polietilenglicol (PEG) / sistema de dextrano (DEX). Los ATPS formadas por estos polímeros de bajo costo y biocompatible fue originalmente descrita para la purificación de biomoléculas por medio de partición molecular ^{2, 10.} Particionamientose produce cuando las moléculas o partículas adicionales que no contribuyen al sistema de fase se mezclan con PEG y DEX. En base a sus afinidades relativas para ya sea DEX o PEG, las moléculas o partículas preferentemente residirá dentro de una de las dos fases o en el interfaz. Otra característica de la ATPS PEG / dex es la existencia de la tensión interfacial entre las dos fases de polímero. ATPSs formados por PEG y DEX generalmente muestran tensiones interfaciales que son mucho más bajos que otros líquido-líquido en sistemas de dos fases, tales como aceite y agua, sin embargo, las fuerzas de tensión interfacial todavía ejercen efectos sobre las pequeñas partículas tales como virus, células y agregados de proteínas ^{2 , 11-13.} Finalmente, puesto que mayor peso molecular de PEG y DEX separado a bajas concentraciones (menos de 5% peso / peso de polímeros de alto peso molecular variedades) en presencia de concentraciones fisiológicas de sales, hay pocos o ningún efectos deletéreos sobre células de mamífero incorporado dentro de estos sistemas^14-16.

Recientemente, las propiedades interfaciales y los efectos de partición de ATPSs han sido aplicadas por nuestro laboratorio para el patrón celular ^{14, 16-20.} Esto se logró por micropatterning una solución más densa DEX sobre sustratos de cultivo de células en presencia de PEG. Cuando las células se incorporan en la fase de PEG, se excluyen la entrada de las gotitas de DEX debido a PEG / dex tensión interfacial ^20. Cuando las células se modelan en la fase de DEX, que son retenidos en la superficie del sustrato de cultivo celular mediante la tensión interfacial y la partición ^{16, 17, 19.}

En contraste con otros métodos para el patrón celular, patrón ATPS celular es fácil de aprender y sólo requiere conocimientos rudimentarios sobre los propios polímeros, y la capacidad para llevar a cabo el cultivo de células y el uso de una micropipeta. Otros métodos para modelar celular implican a menudo el equipo especializado y capacitación que no se traducen fácilmente a the las ciencias biológicas. Por ejemplo, algunos métodos (impresión por microcontacto de impresión de inyección de tinta o) células de patrón indirectamente mediante la aplicación de patrones de biomoléculas adhesivas celulares a un sustrato de cultivo que posteriormente sirven como sitios para la unión celular ^{21, 22.} Aunque los enfoques indirectos son útiles para algunos tipos celulares, que requieren un alto grado de habilidad del usuario y equipo especializado para la fabricación de la herramienta de modelado, y puede carecer de especificidad dependiendo del tipo particular de células / biomolécula patrón. Alternativamente, las células pueden ser depositados con una especificidad alta patrón por medio de enfoques de modelado directos que incluyen patrones de flujo laminar, estarcir y la impresión de inyección de tinta ^23-26. Sin embargo, estas técnicas también requieren experiencia del usuario y equipo especializado, y puede dañar las células durante el proceso de impresión. Si bien estos métodos generalmente producen patrones precisos de células, que permiten definir motivos de células a ser una herramienta útil en las ciencias de la vida, debe ser rentable unnd simple de implementar.

Aquí mostramos un protocolo detallado para la generación de patrones de cultivos celulares utilizando los ATPSs descritos en nuestras aplicaciones previamente publicados. Usando sólo Micropipetas, los usuarios pueden generar zonas de células de exclusión o islas celulares para los ensayos de migración. Esto se consigue por medio de PEG / dex tensión interfacial que o bien conserva las células en la fase de DEX o excluye las células depositadas en la fase de PEG de DEX. Por el peinado de estas dos técnicas fundamentales de dibujo, es posible generar rápidamente co-cultivos de células tales como células de hígado de fibroblastos co-cultivos. Métodos de patterning, parámetros ATPS y los resultados esperados se describen en detalle.

Protocol

1. Fase de caracterización del sistema: Los umbrales determinantes para la separación de fases

1. Preparar soluciones que contienen PEG y DEX en el tampón deseado o medio de cultivo celular como se muestra en la Figura 1 (puntos púrpura) en 15 ml o 50 tubos cónicos ml. En lo sucesivo, PEG y DEX se refieren a PEG de 35 kDa y 500 kDa DEX, sin embargo, concentraciones críticas cambiará en función de los dos polímeros utilizados. Registrar la masa de PEG y DEX en cada solución. Alta concentración de las soluciones de polímero puede tardar varias horas para disolver. Vórtice puede ser utilizado para soluciones libres de suero. Para medios que contienen proteínas o de suero, se colocan los tubos en una etapa balanceo hasta que los dos polímeros se disuelven completamente. Anotar el peso de los medios utilizados para disolver los polímeros y tomar nota de las concentraciones iniciales.
2. Una vez que los polímeros se disuelven completamente, las soluciones deben aparecer turbia. Esta es la primera indicación de que la separación de fases se ha producido. Para confirmar esto, permitir que elsoluciones de polímero a descansar en una posición vertical a temperatura ambiente durante 20 min. La centrifugación a 1.000 xg se puede usar para acelerar el proceso de separación de fases. La fase inferior densa será DEX-rica y la fase superior será PEG-rico.
3. Lentamente añadir tampón adicional o medios de comunicación a los tubos. Pequeños incrementos deben utilizarse a fin de no sobrepasar el punto de separación de fases.
4. Cuando la solución se vuelva clara y ya no se separa de fase después de la centrifugación, el umbral para la separación de fases se ha alcanzado. Registrar el peso final del tubo.
5. Utilizando los pesos anteriores registrados para los polímeros, junto con el peso final tras la adición de medios, determinar el% en peso / peso de cada uno de los dos polímeros en el que la separación de fases ya no se produce.
6. Trazar estos valores en% en peso / peso de PEG en el eje y, y% peso / peso de DEX en el eje x. Esta trama, conocida como la curva binodal, se puede utilizar para determinar el umbral de concentración para la separación de fases para diferentes concentratiComplementos de PEG / DEX en un medio de cultivo celular específica.

2. Configuración 1: Exclusión Patrones (96-así formato de placa)

1. Preparar soluciones separadas de 5,0% peso / peso de PEG y 12,8% DEX peso / peso en medio de cultivo celular. Utilizar soluciones ATPS de al menos dos veces el punto crítico para garantizar que un ATPS permanece después de los polímeros equilibrar con respecto a la otra. Hay una pequeña cantidad de flujo de DEX en la fase de PEG-rico y viceversa, por lo tanto, trabajando demasiado cerca de la concentración crítica puede resultar en la pérdida del sistema de fase como la caída de las concentraciones por debajo del punto crítico. De manera similar, la transferencia de la placa de cultivo celular a una incubadora con humedad y temperatura controladas pueden alterar las propiedades de dos fases y hacer que las dos soluciones miscibles. Nota: Algunas células pueden funcionar mejor con otras formulaciones ATPS. Formulaciones aceptables pueden ser seleccionados en base a las curvas de binodal determinados a partir de la Parte 1.
2. Recoger las células que se utilizarán para la exclusión patteRT ENCIA. Determinar el número total / concentración de células disponibles. Opcional: marcar las células con CellTracker u otros no citotóxicos etiquetas para microscopía de fluorescencia.
3. Sedimentar las células y resuspender el sedimento en un volumen apropiado de 5,0% de PEG para lograr el número deseado de células por exclusión. Por ejemplo, un pocillo de una placa de 96 pocillos requiere 37.500 células de fibroblasto que se resuspendió en 200 l de PEG para producir confluencia el día siguiente. Escala estos números según sea apropiado para otros tipos de células y tamaños de sustrato de cultivo.
4. Usando una micropipeta, dispensar gotas 0,5 l de DEX sobre un sustrato de cultivo celular seco. Las gotas más grandes producen mayores volúmenes de zonas de exclusión. Las gotitas que varían en tamaño desde 0,1 hasta 1 l se recomiendan para micropatterning exclusión. Opcional: DEX gotitas pueden depositarse 24 hr antes de tiempo y se dejó deshidratar a temperatura ambiente. Esto puede producir patrones más limpios.
5. Dispensar 200 l de suspensión celular en t PEGasí que para cubrir las gotas DEX.
6. Colocar en un humidificado incubadora durante 12 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Asegúrese de que el plato no está inclinado durante la manipulación y que se coloca en un nivel de estantería incubadora para evitar la interrupción de los patrones.
7. Quitar la solución de PEG y se lava tres veces con 200 l de medio de cultivo.
8. Añadir medio de cultivo fresco y el retorno a la incubadora.
9. Monitorear las culturas periódicamente para observar el movimiento celular en la zona de exclusión.

3. Configuración 2: La isla Patrones (96-así formato de placa)

1. Se preparan soluciones de 5,0% en peso / peso de PEG y 12,8% DEX peso / peso en medio de cultivo celular, como anteriormente.
2. Recoger las células para ser utilizadas para modelar isla. Determinar el número total / concentración de células disponibles.
3. Pellets y resuspender las células en un volumen apropiado de DEX 12,8% para alcanzar la concentración deseada de células para el patrón isla. Las concentraciones de 5.000 ceLLS / l o menos se recomienda para tipos de células fuertemente adherentes. Para las células que tienen dificultad para montar o células que se adhieren débilmente, concentraciones de hasta 10.000 células / l puede ser considerado.
4. Trabajando con rapidez para evitar el secado, las gotitas de pipeta 0,5 l de DEX sobre un sustrato de cultivo celular seco, como se describió anteriormente. No permitir que las gotas a secar. Opcional: 200 l de solución de PEG se puede añadir a la bien delante de tiempo. Gotitas DEX entonces puede ser depositado en la solución de PEG donde se hunden hasta el fondo y en contacto con la superficie de cultivo. Esto puede producir patrones más limpios de la isla.
5. Cubra las gotas de DEX con 200 l de PEG.
6. Colocar en un humidificado incubadora durante 12 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Asegúrese de que el plato no está inclinado durante la manipulación y que se coloca en un nivel de estantería incubadora para evitar la interrupción de los patrones.
7. Quitar la solución de PEG y se lava tres veces con 200 l de medio de cultivo.
8. Añadir cultivo frescomedio y retorno a la incubadora.
9. Monitorear las culturas periódicamente para observar el movimiento celular y proliferación hacia el exterior de las islas.

4. Configuración 3: Exclusión Co-culturas (96-así formato de placa)

1. Se preparan soluciones de 5,0% en peso / peso de PEG y 12,8% DEX peso / peso en medio de cultivo celular, como anteriormente.
2. Recoger las células que se utilizarán para la exclusión y el patrón isla. Determinar el número total / concentración de células disponibles para cada tipo de célula. Opcional: Algunas parejas celulares pueden mostrar índices de proliferación dramáticamente diferentes. Para evitar que las células excluidos de sobrepoblación de las células insulares patrón (especialmente para cultivos a largo plazo), el tratamiento de las células usadas para la exclusión con mitomicina C durante 2 horas o irradiar ellos antes de la cosecha. Esto evitará la proliferación. Los tintes fluorescentes CellTracker se puede utilizar para distinguir las dos poblaciones de células si es necesario.
3. Pellet las células y resuspender el pellet de exclusion patrones en un volumen apropiado de 5,0% de PEG para lograr el número deseado de células, como anteriormente. Resuspender el precipitado para modelar isla en un volumen apropiado de 12,8% DEX para conseguir la concentración deseada de células, como anteriormente.
4. Usando una micropipeta, dispensar gotas 0,5 l de suspensión celular DEX sobre un sustrato de cultivo celular seco. No permitir que las gotas a secar.
5. Cubrir las gotitas de DEX con 200 l de suspensión celular PEG.
6. Colocar en un humidificado incubadora durante 12 horas a 37 ° C, 5% de CO _2. Asegúrese de que el plato no está inclinado durante la manipulación y que se coloca en un nivel de estantería incubadora para evitar la interrupción de los patrones.
7. Quitar la solución de PEG y se lava tres veces en 200 l de medio de cultivo.
8. Añadir medio de cultivo fresco y el retorno a la incubadora.
9. Monitorear los co-cultivos de observar la interacción entre poblaciones de células. Opcional: Los controles pueden ser preparados mediante la realización de exclusión o isla patrón individually, por las células de co-cultivo que no interactúan o bloqueando las rutas de interés en una o ambas poblaciones de células antes o después de los patrones.

Results

Para seleccionar una combinación apropiada de PEG y DEX para el patrón de células es importante para determinar la curva binodal. Esta curva delimita los puntos en los que un ATPS pueden formar y pueden variar para un conjunto dado de polímeros basada en la temperatura, pH y contenido iónico. Para el cultivo de células que requieren formulaciones personalizadas medio puede ser necesario para determinar experimentalmente la curva binodal. Esto se logra mediante la generación de una serie de ATPSs que están lejos de la bi...

Discussion

La célula ATPS micropatterning método requiere conocimientos muy poco más allá de la competencia en técnicas de cultivo celular y se puede dominar rápidamente. Las ventajas de este enfoque son que es barato, rápido y compatible con una variedad de tipos de células y formatos de cultivo. Por estas razones, el protocolo debe ser fácilmente adoptada por científicos de la vida, en particular los que estudian la proliferación celular, la migración y la quimiotaxis, y la influencia de las interacciones yuxtacrina y paracrina ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo	Fabricante
500.000 kDa dextrano	Pharmacosmos, Dinamarca
Polietilenglicol 35.000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Suero Bovino Fetal	Gibco, Carlsbad, CA