Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Published: April 4, 2013 doi: 10.3791/50310
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 1
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

Summary

En metod för montering av lim och lösliga gradienter i en mikroskopi kammare för levande studier cellmigration beskrivs. Den modifierade miljö kombinerar antifouling ytor och lim spår med lösning gradienter och därmed gör det möjligt att bestämma den relativa betydelsen av vägledning ledtrådar.

Abstract

Celler kan känna och migrera mot högre koncentrationer av vidhäftande signaler såsom glykoproteinerna av den extracellulära matrisen och lösliga ledtrådar såsom tillväxtfaktorer. Vi presenterar här ett sätt att skapa motsatta gradienter av lim och lösliga ledtrådar i en mikroflödessystem kammare, som är kompatibel med levande cell imaging. En sampolymer av poly-L-lysin och polyetylenglykol (PLL-PEG) användes för att passivera täckglas och förhindra icke-specifik adsorption av biomolekyler och celler. Nästa, mikrokontakttryckning eller dopp penna litografi används för att skapa spår streptavidin på de passiverade ytorna för att tjäna som förankringspunkter för den biotinylerade peptiden arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) som den adhesiva kö. En mikrofluidikanordning placeras på den modifierade ytan och används för att skapa gradienten av adhesiva ledtrådar (100% RGD till 0% RGD) på streptavidin spåren. Slutligen, används samma mikroflödessystem anordning som används för att skapa en gradient av en kemoattraherande framgångsrikah som fetalt bovint serum (FBS), som den lösliga kö i motsatt riktning av gradienten av adhesiva signaler.

Introduction

Riktad cellmigration är en grundläggande egenskap hos många celler och är en viktig del av många normala fysiologiska processer, inklusive embryonal utveckling, försvar mot infektioner och sårläkning. Dessutom spelar cellmigration också en framträdande roll i många sjukdomar, såsom vaskulär sjukdom, tumörcellmetastas och kronisk inflammation 1,2. Medan de klassiska stater cellmigration - polarisation, utskjutande förlängning, bildandet av vidhäftning, styrkebidrag och bakre indragning - är allmänt accepterade 3,4 har klarlägga Spatiotemporal mekanismer genom vilka signalen integration samordnade varit mer utmanande.

Den extracellulära matrisen (ECM) fungerar som ett substrat för cellvidhäftning, och genom inneboende kemisk 5 och fysikalisk 6 mångfald, erbjuder riktade signaler för cell navigering 7,8. Utöver dessa adhesiva signaler 9, lösliga faktorer 10-12 </ Sup>, t.ex. kemokiner och tillväxtfaktorer kan inducera riktad cellmigrering genom chemoattractant receptorer och deras nedströms motogenic signalering. För närvarande är det inte känt om engagemang och signalering genom adhesionsreceptorer (dvs. integriner) eller chemoattractant receptorer, såsom receptor (RTK), dominerar. Det är inte heller känt om hierarkier av receptorsystem är celltyp specifik.

Levande celler mikroskopi ger en mängd information som inte är tillgänglig i bulk analyser och kan kombineras med mikroflödessystem enheter för att generera gradienter av immobiliserade 13,14 och lösliga ledtrådar 15 16. Den metod som beskrivs här använder en serie enkla och etablerade steg för ytmodifiering i samband med en kommersiellt tillgänglig mikroflödessystem kammare för att skapa en avbildning test för cellmigration som lätt kan implementeras i en cellbiologi laboratorium (figur 1). Den sammansattamikroflödessystem enhet har optiska egenskaper som är jämförbara med glas 17 och gradienter av diffunderbara molekyler är stabila under minst 16 timmar. Systemet kan användas för epifluorescens och avancerade mikroskopitekniker. Till skillnad från andra kemotaxi uppställningar 18, är detta system lämpligt för inspelning långsamt migrerande, vidhäftande celler. Viktigt är systemet modulärt och lätt tillåter införandet av alternativa lim eller lösliga ledtrådar migration och granskning av olika celltyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Passivering av täckglas med PLL-PEG-biotin

Detta steg syftar till att passivera ytan så att celler fästa och migrera till specifika regioner på täckglas som skapas med microcontract utskrift (Steg 2-3a) eller dopp penna litografi (steg 3b). För passivering, är en sampolymer av poly-L-lysin (PLL) och polyetylenglykol (PEG) används i vilken 20% av PEG-molekyler är ympade till biotin (PLL-PEG-biotin).

  1. För att rengöra täckglas (18 mm x 18 mm), översvämmas dem i ett rack i 100% etanol och plats i racket i ett ultraljudsbehandling bad under 30 minuter. Torka glaset täckglas i luft eller under en ström av kväve.
  2. Nästa, sonikera för täckglas för 30 minuter i 1 M NaOH. Efteråt skölj glasytorna genom att försiktigt doppa stället i en bägare fylld med 1,5 L Milli-Q H 2 O. Upprepa sköljningen processen tre gånger med färska Milli-Q H 2 O varje gång. Torka glaset täckglas ien ugn vid 60 ° C.
  3. Placera halv av den rena täckglas individuellt i en fuktig kammare, som är gjord av en 24-brunnars platta delvis fylld med H 2 O Drop 15 pl av PLL-PEG-biotin (1 mg / ml) i PBS på varje täckglas. Ta den andra hälften av de återstående rena täckglas och försiktigt smörgås PEG lösningen. Låt täckglasen under 1 timme i fuktkammaren. Skjut lagda täckglasen försiktigt bort från varandra utan att skrapa PEG-belagda ytan och skölj dem med Milli-Q H 2 O. Vattnet bör glider lätt på PEG-behandlade sidan. Om det behövs, luft-torka täckglas på pappershandduk med den behandlade ytan uppåt. Förvara täckglas i en vakuumexsickator tills vidare användning.

2. Tillverkning av stämplar för mikrokontakttryckning

Vi beskriver två processer till spår mönster streptavidin på de passiverade glas. Den första, microcontact utskrift vanligtvis kräver tillverkning av en kisel mästare från vilken en PDMS stämpel gjuts. I vårt fall, mönstret på PDMS stämpeln är 100 nm hela linjer som är placerade 290 nm centrum till centrum med en funktion höjd 25 um. Nedan beskriver vi kortfattat hur att tillverka en lämplig kisel mästare (steg från 2,1 till 2,3) och PDMS stämpel (steg 2,4). Det finns dock flera protokoll för mikrokontakttryckning beskrivna i litteraturen 19-23, vilka är lämpliga för tryckning proteinmönster på täckglas. Masters kan också skräddarsys och köpas från kommersiella källor.

  1. Först, rengör kiselskivan (4 "i diameter) genom att inkubera den i piraya lösning (3:1 volym: volym av svavelsyra och 30% väteperoxid). Under 20 min Skölj skivan noggrant 10 gånger med MilliQ H 2 O Torka skivan i en ugn vid 150 ° CO / N.
  2. Skölj rent och torkade kiselskiva med 100% aceton, följt av 100% isopropylalkohol. Nästaspin-coat 2 ml GM1070 SU-8 fotoresist (Gersteltec Sarl) på skivan vid 3.100 rpm i 40 sekunder för att skapa en 25 nm tjockt lager. Provet är sedan bakas på en varm platta vid 65 ° C under 5 min följt av en ytterligare 5 min vid 95 ° C.
  3. Exponera SU-8 fotoresist för UV-ljus för 60 sekunder under en fotomask med det önskade mönstret (exempelvis med hjälp av en Quintel Q6000 mask Aligner) och upprepa gräddningen beskriva 2,2. Därefter provet utvecklas genom nedsänkning av skivan i SU-8 framkallare (Gersteltec Sarl) under 4 min, sköljdes i 100% isopropylalkohol och torkades under kväveflöde. Området för SU-8 fotoresist som inte exponerades för UV-ljus avlägsnas sålunda, skapar det omvända mönstret av PDMS stämpeln.
  4. Nästa steg är att gjuta en PDMS stämpel från kisel mastern. Först, grundligt blanda 1 del (vikt / vikt) av härdningsmedlet med 10 delar elastomer prepolymer (Sylgard 184). För att avlägsna eventuella luftbubblor, avgasa blandningen i en exsickator kopplad till en vakuumledningunder 1 timme. Därefter häll PDMS elastomeren på kisel mastern inuti en petriskål till ca 1 cm i höjd och härda master och PDMS blandningen i en ugn vid 70 ° C under 1 timme. Slutligen PDMS stämpeln avlägsnas från mastern kisel och skars till storlek.

3. Patterning Streptavidin eller Självhäftande Cues på passiverat täckglas

Efter passivering täckglas är proteinmönster ut med mikrokontakttryckning (Steg 3a) eller dopp-penna litografi (steg 3b). I vårt fall är streptavidin ut som linjer, som utgör grunden för RGD gradienter (Steg 4). Samma procedur kan också användas för utskrift av matrisproteiner att skapa limmönster.

En alternativ metod för att mikrokontakttryckning för mönstring av biomolekyler på ytor är dip penna litografi. I DIP penna litografi, är en fribärande används för att överföra en liten volym av lösningen på ytan. Storleken på utliggare, viscosity av lösningen, kontakttid av konsolen på ytan, hydrofobicitet hos ytan och fuktigheten i kammaren tryckning bestämmer storleken på de tryckta funktioner. Fördelen med denna metod är att olika mönster kan tryckas för varje experiment, eftersom det inte är nödvändigt att tillverka befälhavare och stämplar. Nackdelen är att det tar längre tid att skriva ut ett givet mönster och att DIP penna litografi kräver en specialist instrument som kanske inte finns i många laboratorier. Dip penna litografi instrument som vi använde var NanoeNabler från Bioforce nanovetenskap. Här skrivs vi små prickar som var <10 nm i diameter, som vi använde SPT10 utliggare.

3a. Mikrokontakttryckning (μCP) Teknik

  1. För att rengöra och göra PDMS stämpeln mer hydrofil, behandla den mönstrade sidan av PDMS stämplar i en UV och ozon (t.ex. UV-ozon Procleaner från Bioforce Nanovetenskap) under 1,5 timmar. Alternativt kan du använda en plasmarengöringsmedel för en kortare tid för samma ändamål. Denna process skapar en oxiderad PDMS yta 24, som förbättrar tryckprocessen.
  2. Omedelbart efter ozon eller plasmabehandling, plats och sprida 10 pl streptavidin (1 mg / ml i PBS) på PDMS stämplar och låt stå 1 timme i en fuktig kammare (såsom en delvis fylld 6-brunnars platta, se steg 1,3) . Om spår bör vara synlig under fluorescensmikroskop, använd streptavidin som är konjugerat till en fluorofor såsom streptavidin-AlexaFluor350.
  3. Ta bort överflödigt streptavidin från stämpeln med silkespapper och luft torka stämpel för ca 1 minut. Tryck lätt stämpeln på PLL-PEG-biotin-belagd täckglas.
  4. Om fluorescerande streptavidin användes i steg 3.a2 undersöka mönstret med i ett epifluorescensmikroskop. Förvara tryckta ytor i en exsickator.

3b. Dip Pen Litografi

  1. Först, blanda 1 del av 1 mg / ml streptavidin eller streptavidin-AlexaFluor350 med 10 delar glycerol (volym / volym) och ladda 5 pl av blandningen på fribärande. Sedan börjar tryckprocessen som beskrivs i bruksanvisningen till dopp pennan litografi instrument. För att minska punktstorleken till ungefär 5 um, justera utskriftshastigheten, kontakttid av konsolen på ytan eller vertikala avståndet av konsolen till ytan. I exemplet som visas i figur 2c, har prickar tryckta i en linje med rad och kolumn separering inställd till 10-15 um. Detta avstånd är tillräckligt för att förhindra punkter från övergår i varandra, men tillåter visning av flera punkter i ett enda synfält med de flesta mikroskop inställningar.
  2. Förvara tryckta ytor i en exsickator.

4. Skapa Självhäftande Gradienter PÅ Streptavidin-mönster ytor

Vi skapar självhäftande gradienter av biotin RGD-på täckglas som är belagda med streptavidin (figur 3) eller contain streptavidin mönster på passiverade täckglas (Figur 5). För att skapa en yta lutning använde vi en kommersiellt tillgänglig mikroflödessystem enhet (kallas klibbiga-Slide Kemotaxi 3D från Ibidi) som skapar en stabil lösning lutning genom passiv diffusion. Att konkurrera om streptavidin bindningsställen, använde vi två motsatta gradienter av biotin-RGD och biotin som inte var konjugerad till RGD (se figur 1).

  1. Följ de streptavidinbelagda eller-mönstrat glas täckglas på den klibbiga sidan av den klibbiga-Slide Kemotaxi 3D enhet. För att säkerställa att det inte finns något läckage i flera timmar, är kanterna hos anordningen förseglades med ett tunt skikt av värmas vaselin och med ett andra skikt av en blandning av 1 del av vaselin till 1 del av paraffinvax (vikt / vikt).
  2. Fyll kanal hos anordningen med 6 | il PBS i kanalen. Fyll sedan de två behållarna med 70 pl av 0,03 pg / pl biotin-4-fluorescein i PBS och 70 & mU, l 0,03 pg / pl biotin-RGD i PBS, respektive. Inkubera proverna vid RT i mörker under 1 timme.
  3. Ta biotin lösningar och försiktigt skölja ytan medan den fortfarande fäst vid mikrofluidanordningen två gånger med PBS. Markera riktning limmet lutning och om det behövs, förvara inte enheten fylld med PBS vid 4 ° C i men se till att enheten inte torkar ut. Om så erfordras, analysera den adhesiva gradienten med ett fluorescensmikroskop.

5. Märkning av celler med fluoroforer för levande cell imaging

Celler märkta med fluorescerande färgämnen som hjälper cellen spårning under fluorescensmikroskop. Vanliga sonder är fluorescerande organell markörer, såsom Syto 64 Röd, vilka etiketter cellkärnan. För att göra detta, är celler först tvättas tre gånger med PBS, varefter de inkuberades med 1 pM Syto 64 rött i odlingsmedia för 45 minuter och tvättades slutligen ytterligare tre gånger med PBS. Observera att cellerna inte börförvaras i PBS under långa tidsperioder.

Alternativa färgämnen för cell-spårning är CellTracker serie som fläckar cytoplasman och bibehålls under cellmigration och division. Transfektion av celler med fluorescerande fusionsprotein är särskilt användbar för att registrera de subcellulära fördelningen av ett protein av intresse under flyttningen. Men fluorescerande proteiner vanligtvis foto-blekmedel snabbare än organiska färgämnen, så att långsiktiga observationer inte kan vara möjligt.

6. Lastning av celler med en löslig Gradient i Mikrofluidik enhet

  1. Räkna fluorescentmärkta celler och delas upp i två rör med samma cellantal. Tvätta och återsuspendera ett rör av celler med medium innehållande den kemoattraherande, såsom låg glukos Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS). Tvätta och återsuspendera det andra röret av celler i media utan chemoattractant, dvs DMEM med 0% FBS. Den slutliga koncentrationenav celler i varje rör bör vara 5 x 10 5 celler / ml.
  2. Ta bort alla lösningar från den mikroflödessystem enheten (från steg 4,3) och placera den på mikroskop scenen (se steg 7). Ladda 70 | il av celler (5 x 10 5 celler / ml i 0% FBS DMEM) i en reservoar och 70 pl av HeLa-celler (5 x 10 5 celler / ml i 10% FBS DMEM) till en annan. Löst placera ett band över behållarna för att undvika avdunstning. Om celler på ytan är förinkuberades före avbildning, är det tillrådligt att cellerna laddas in i anordningen i tillväxtmedia utan gradienten. Anordningen placeras sedan på mikroskopets objektbord och media ersattes med lutning medium, dvs DMEM utan FBS i en behållare och DMEM med 10% FBS i den andra.

7. Levande cell imaging och dataanalys

  1. Slå på mikroskop (Nikon Ti-E) och värma upp scenen minst 1 timme innan experimentet.
  2. Säkerställ att kanalen av MICRofluidic enheten är i synfältet och celler i fokus. Välj parameter bildtagning som exponeringstider och fluorescerande filter, bild sekvens av ljus fält och fluorescens som fångar celler och spår samt punkter tid och inspelningslängd (t.ex. var 15 min under 16 timmar).
  3. Analysera data med lämpliga mjukvaror som ImageJ Manuell spårning eller Ibidi Kemotaxi och Migration Tool.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att förstå hur celler integrerar vandrande signaler 25, har vi utvecklat en metod för att avbilda celler med fluorescensmikroskopi som vandrar i en miljö med konkurrerande lim och lösliga gradienter (figur 1). Självhäftande spår som innehöll fluorescerande streptavidin och biotinylerad RGD skapades med microcontact tryckta spår och dopp penna litografi (Figur 2). Framgångsrik mikrokontakttryckning indikeras med linjen profilen för fluorescensintensiteten över spåren där adhesiva spår och påväxthindrande regioner kan tydligt särskiljas (figur 2b). Prickar skrivs ut med dopp penna litografi visas rundade, inte riva formad, vilket indikerar en lyckad tryckprocess. Ytkemi och fuktighet påverkar resultatet av tryckningsprocessen. Generellt sett, den mer hydrofoba ytan är, desto bättre utskrift resultaten.

En gradient av självhäftande signalerpå den tryckta banan skapades med en enkel mikroflödessystem anordning genom att ladda biotin-4-fluorescein och biotin-RGD till den motsatta sidan av en mikrofluidisk kammare (Figur 3). Eftersom båda molekyler binder kompetitivt till streptavidin spåret på glasytan, är en immobiliserad gradient av RGD ligander genereras. Efter avlägsnande av biotin / biotin-RGD lösning, kan samma kammare användas för att införa en löslig gradient, som är stabil inom mikroflödessystem kanalen under minst 16 timmar (Figur 4).

Vi introducerade HeLa-celler in i kammaren med en kemoattraherande lutning, för vilken FBS användes. Vid låga tätheter, HeLa-celler vidhäftade företrädesvis till och migrerade på streptavidin / RGD spår (N-celler = 50) och undvek de beväxningsförhindrande PEG regioner (N-celler = 19). Placeringen av enskilda celler registrerades över 16 timmar och analyserades med en cell spårningsprogram. I ett experiment där lim och lösningarriella gradienter är emot varandra (Figur 5), visade banor enskilda celler att fler HeLa-celler migrerat till källan till chemoattractant (röda spår i figur 5c, N spår = 36) än mot högre koncentrationer av vidhäftande RGD (svart spår i fig 5c, spår N = 14). Det genomsnittliga avståndet att celler migrerat mot (svarta spår) eller i (röda spår) riktning FBS gradient (x-komponenten av genomsnittlig förskjutning av varje bana) var 0,1700 ± 0,1172 och 0,2278 ± 0,1280 respektive (P <0,0001, Student t-test) men det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad i genomsnittlig förskjutning mellan de svarta spåren (56,18 ± 32,27 ^ m) och de röda spår (72,86 ± 45,05 ^ m, P> 0,05, Students t-test). HeLa-celler migrerar med en genomsnittlig hastighet av 17,47 ± 4,72 fim / h i närvaro av både gradient av bindemedelcue (dvs. RGD) och lösliga kö (dvs. FBS). Uppgifterna tyder därför på att för HeLa-celler, bestämmer FBS lutning riktning av migration, medan cellerna upprätthåller en inneboende migration hastighet på limmet spår.

Vi har också bedömt migration av makrofagcellinje J774. I avsaknad av lim och lösliga gradienter, dessa celler migrerar med mycket högre hastighet (38,55 ± 17,88 um / h) än HeLa-celler (16,47 ± 4,28 um / h) men med mindre persistens, dvs J774-celler ändrar riktning (riktningen på 0,059 ± 0,091 ), mätt som förhållandet mellan förskjutningen för att spåra längd oftare än HeLa-celler (0,57 ± 0,12) på microcontact tryckta fibronektin spår. J774-celler är också mindre kontakt beroende än HeLa-celler. Förskjutningen av J774-celler var högre på PEG regionerna (102,20 ± 54,73 nm) än på fibronektin spår (42,95 ± 39,90 nm). Dessutom, J774-celler appeared att anpassa sig till olika ytkemi genom att ändra sin mekanism migration från mesenkymala till amoeboid. Sammanfattningsvis adhesiva signaler är inte lika viktiga för J774-celler som de är för HeLa-celler. Båda celltyper migrerade företrädesvis mot riktningen för den lösliga kö.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av tillverkningsprocessen av ett mikroflödessystem installation som möjliggör avbildning av migrerande celler svarar på motsatta gradienter av lim kontra löslig ledtrådar. Ett. Täckglas passiveras med biotinylerad PLL-PEG. B.. Är limmönster innehållande fluorescerande streptavidin tryckt på biotinylerade yta antingen som rader med mikrokontakttryckning (b) eller punkter med DIP penna litografi (b '). c.. D.. Celler och ett lösligt kemoattraherande gradient av 0-10% FBS laddas i mikrofluidanordningen. Efter celler vidhäfta till ytan, levande cellmigrering över RGD gradienter på streptavidin spår och i närvaro av FBS gradienter kan avbildas i kanalen som förbinder de båda behållarna.

Figur 2
Figur 2. Cell limmönster (linjer och punkter) kan genereras med två olika trycktekniker en fluorescerande bild av microcontact tryckt streptavidin-AlexaFluor350 spår (Abs: 346 nm, Em: 442 nm, grå).. På PLL-PEG-belagda täckglas. Den microcontract tryckmask utformades som linjer som var 100 nm bred med 290 nm centrum till center utrymme. b.. den genomsnittliga fluorescensintensiteten av microcontact tryckta streptavidin spår, som visas i en, från fem olika ytor som tvärsnitt från topp till botten. Den genomsnittliga bredden på banan är 90 ± 6 um och den genomsnittliga centrum-till-centrum avståndet är 293 ± 2 fim. C.. En brightfield bild av streptavidin-innehållande punkter genererade med dopp penna litografi. Diametrarna hos prickarna varierade från 6 till 9 pm med 15 | im centrum till centrum utrymme. Skala barer i en och c är 100 um.

Figur 3
Figur 3. Biotin-4-fluorescein-gradient (0 ug / ul - 0,03 pg / pl). På en glasytor likformigt belagda med streptavidin Biotin-4-fluorescein och biotin-RGD laddades i endera reservoar mikrofluidanordningen (sticky-Slide Kemotaxi 3D , Ibidi) som ärförbundna med en 1 mm lång kanal. Efter en 1 h inkubation anordningen sköljdes med PBS och återfyllas med PBS. Ett. Var 60 mosaik bilder som tagits med en total bild längd 3.072 um och b fluorescensintensiteten mättes över längden av hela mosaiken. Linjära trendlinjer anpassades till fluorescensintensiteten att indikera RGD gradienten i kanalen.

Figur 4
Figur 4. Fluorescensintensiteten hos en fluorescein-gradient (0 pM - 1 pM) i mikroflödessystem kanalen en omedelbart efter installation (T = 0 h) och b efter en 16 h inkubation PBS utan och med 1 pM fluorescein laddades från vänster och höger. reservoar mikrofluidanordningen (klibbiga-Slide Kemotaxi 3D, Ibidi), respektive. Mikroflödessystem kanal är 1 mm i längd ochfinns vid position 50 till 1.050 um. Gradienten var stabil under minst 16 timmar.

Figur 5
Figur 5. HeLa-cell migration i en mikrofluidik kammare (sticky-Slide Kemotaxi 3D, Ibidi) med motsatta självhäftande gradient (immobiliserade RGD på streptavidin spår) och lösliga gradient (0-10% FBS). A. En representativ bild av celler i en mikrofluidik kammare med motsatta gradienter. Skala bar är 50 nm. B Time-lapse bilder i en cell tillsammans med ett epifluorescensmikroskop (Nikon Ti-E). Bilder togs vid 15 min intervaller för 20 timmar och cell bana (blå linje) erhålls via cell centroid positionering (ImageJ manuell spårning plugin). Skala bar är 50 nm. C.. Cell bana från bilder som visas i b. Cell trajectories som övergått till den högre koncentrationen av löslig FBS visas i rött (N spår = 36), cell banor som övergått till högre koncentrationer av vidhäftande RGD visas i svart (N spår = 14). Klicka här för att se större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll använde vi en kommersiellt tillgänglig mikroflödessystem enhet (klibbiga-Slide Kemotaxi 3D från Ibidi) för att studera effekterna av kemiskt modifierade ytor och chemoattractant gradienter på cellmigration. Denna mikroflödessystem inställning kräver inte flöde eftersom gradienten etableras genom diffusion längs kanalen. Detta är viktigt eftersom flödet kan differentiellt påverka långsamt migrerande celler såsom fibroblaster som bildar stabila fokala adhesioner och snabba migrerande celler som de flesta leukocyter som bildar små fokala komplex och synapser 26. Skjuvspänning från laminärt flöde kan påverka stabiliteten i celladhesion till adhesiva signaler och kemotaxi cell mot lösliga ledtrådar 27,28. Vi hittade skillnader i migrationen beteende mellan långsamma rörliga HeLa-celler och snabbrörliga J774-celler och därmed visar att det mikroflödessystem inställningen gäller för både fastsittande och mindre vidhäftande celltyper. Sådana jämförelser reveale ocksåd intressant skillnad mellan celltyper i vidhäftning och migration svar på ytmönster som innehöll både självhäftande ledtrådar (RGD-peptider eller fibronektin) och anti-fouling regioner (PEG områden).

Ytmönster skapades med mikrokontakttryckning 29 och dopp-penna litografi 30,31. Mikrokontakttryckning är en enkel och relativt snabb, reproducerbar mönstring processen. Emellertid, är utformningen och tillverkningen av PDMS stämpeln, vilket uppnås genom fotolitografi, mer engagerade och tidskrävande. Det införs också sina egna begränsningar i att små funktioner (<5 pm) är svåra att uppnå och beror på bildformatet på mönstret. I korthet är mikrokontakttryckning idealisk för stora mönster upp till hundratals mikrometer storlek och experiment, där samma mönster måste skapas många gånger. Å andra sidan, kan dopp stift litografi kan användas för att generera mikron till nanoscaled mönster. Det är mer lämpade för utskrift prickarän linjer, kan även om linjerna tillverkas. Dip stift litografi ger större frihet i utformade mönster, eftersom det inte finns något behov av prefabricerade masker, master-eller frimärken. Emellertid är hastigheten för mönstring processen långsam, vilket gör utskrift av stora områden besvärliga och tillgång till en specialiserad instrument är avgörande. De två mönstring metoder är relevanta för behandling eftersom storleken och formen på självhäftande cue mönster påverkar organisationen och distributionen av biomekaniska maskineri som reglerar cellmigration 32,33. Dessutom, är begränsningen av den kommersiella mikrofluidanordning användes här att kanallängden (1 um) inte kan ändras och så att man inte kan styra den maximala brantheten av de vidhäftande och lösliga gradienter. Om brantare lutning är nödvändiga, skulle man behöva tillverka en mikroflödessystem enhet med en kortare kanal mellan de två reservoarerna. En viktig fördel med det protokoll som beskrivits här är den modulära designen, så att olika Surfaces, kemier yta, metoder mönstring och mikrofluidikanordningar kan kombineras för en mängd olika live experiment cell imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inga kommersiella intressen att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna erkänner finansiering från Australian Research Council och National Hälsa och Medical Research Council i Australien och även tacka Australian National tillverkning anläggning för SU-8 mästare för microcontact utskrift. SHN stöds av ministeriet för högre utbildning Malaysia och Universiti Sains Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass staining outfits Thomas Scientific 8542 E40 Coverslip rack
Oven Binder ED 53 series
Silicon wafer Silicon Quest 708-007 Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished
GM1070 SU-8 photoresist Gersteltec Sarl
SU-8 developer Gersteltec Sarl
Sylgard 184 curing agent Dow Corning
Sylgard 184 elastomer prepolymer Dow Corning
PLL-PEG-biotin (20%) SuSos AG PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) 1 mg/ml in PBS
Fluorescein Sigma 46955 1 mM in PBS
Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249 1 mg/ml in PBS
Biotin-4-fluorescein Invitrogen B-1370 0.03 μg/μl in PBS
Biotin-RGD GenScript SC1208 0.03 mg/ml in PBS
Syto 64 Red Invitrogen S-11346 1 μM in PBS
Sticky slide chemotaxis 3D Ibidi 80328
200 μl Greiner yellow bevelled tip Greiner Bio-One 739261
Vaseline Sigma 16415
Paraffin wax, mp 55-57 °C Sigma 327204
Nano eNabler 10 μm cantilever BioForce SPT-S-C-10s
Image J software National Institute of Health rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin Fabrice Cordelières rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration Tool Ibidi GmbH www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Tags

Bioteknik mikrobiologi Cellulär biologi biokemi molekylärbiologi biofysik cellmigration levande cell imaging lösliga och fastsittande gradienter mikrokontakttryckning doppa pennan litografi mikrofluidik RGD PEG biotin streptavidin kemotaxi kemoattraherande avbildning
Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., … More

Ngalim, S. H., Magenau, A., Zhu, Y., Tønnesen, L., Fairjones, Z., Gooding, J. J., Böcking, T., Gaus, K. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (74), e50310, doi:10.3791/50310 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter