La formación del epitelio prostático humano utilizando tejido recombinación de roedores Urogenital mesénquima seno y células madre humanas

Resumen

Para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la próstata primeros sistemas innovadores modelos humanos y enfoques cáncer de iniciación, la novela y se necesitan desesperadamente. El potencial de pre-prostática seno urogenital mesénquima (UGSM) para inducir a las poblaciones de células madre pluripotentes para formar el epitelio de próstata humano es una poderosa herramienta experimental en la investigación de próstata.

Resumen

Los avances en la investigación del cáncer de próstata es muy limitada por la disponibilidad de sistemas de modelos de origen humano y de la hormona-naïve, que limitan nuestra capacidad de entender los eventos genéticos y moleculares que subyacen a la próstata inicio de la enfermedad. Hacia el desarrollo de mejores sistemas modelo para el estudio de la carcinogénesis de próstata humano, nosotros y otros han aprovechado la única potencial inductivo pro-prostática de embriones de roedores estroma prostático, denominada seno urogenital mesénquima (UGSM). Cuando se recombina con ciertas poblaciones de células pluripotentes tales como células madre embrionarias, UGSM induce la formación de epitelio humano normal de la próstata de una manera dependiente de la testosterona. Este sistema modelo humano puede utilizarse para investigar y probar experimentalmente la capacidad de los candidatos genes de susceptibilidad al cáncer de próstata a un ritmo acelerado en comparación con los estudios típicos de roedores transgénicos. Dado que las células madre embrionarias humanas (hESCs) pueden ser modificadas genéticamente en la cultura using de expresión génica inducible o siRNA vectores knock-down antes de la recombinación tejido, tal modelo facilita la prueba de las consecuencias funcionales de los genes, o combinaciones de genes, que se piensan para promover o impedir la carcinogénesis.

La técnica de aislar poblaciones puras de células UGSM, sin embargo, es un reto y el aprendizaje a menudo requiere alguien con experiencia anterior para enseñar personalmente. Por otra parte, la inoculación de mezclas de células bajo la cápsula renal de un huésped inmunocomprometido puede ser técnicamente difícil. Aquí describimos e ilustramos el aislamiento adecuado de UGSM a partir de embriones de roedores y renal implantación cápsula de mezclas de tejidos para formar el epitelio prostático humano. Este enfoque, en su fase actual, requiere xenoinjerto in vivo de las células madre embrionarias; aplicaciones futuras podrían incluir potencialmente en la formación de la glándula o el uso in vitro de poblaciones de células madre pluripotentes inducidas (iPS).

Introducción

Hay una tremenda necesidad de mejores sistemas de modelos humanos de cáncer de próstata. En particular, sistemas de modelos humanos pertinentes de tejidos de próstata normales, no malignas que pueden ser manipuladas genéticamente para discernir directamente el papel de genes específicos en la iniciación del cáncer de próstata serían muy informativo. El advenimiento de la era genómica ha identificado numerosos genes que pueden tener un papel en la formación del cáncer. La falta de sistemas de modelos experimentales humanos, sin embargo, perjudica gravemente nuestra capacidad para probar y caracterizar funcionalmente genes candidatos de susceptibilidad al cáncer de próstata. Un sistema modelo ideal sería facilitar los análisis funcionales rápidos y más rápida de genes de susceptibilidad al cáncer en combinación con sistemas de modelos de roedores transgénicos adecuados. Por otra parte, un sistema modelo humano tal permitiría la caracterización molecular de los mecanismos de señalización de la carcinogénesis de próstata hacia el descubrimiento y validación de nuevas terapias paraevitar la formación de cáncer de próstata.

Células madre embrionarias humanas (hESCs) son capaces de formar los tejidos prostáticos humanos como xenoinjertos. En 2006 Taylor, et al. Informó que hESCs pueden ser inducidas a formar epitelios de próstata in vivo cuando se re-combinado con roedores seno urogenital mesénquima (UGSM) dentro de un período de tiempo de 8-12 semanas. ¹ Estos estudios se basaban en el trabajo previo de el laboratorio Cunha que muestra que roedores UGSM embrionario puede promover la diferenciación de las células madre de próstata y poblaciones de células epiteliales embrionarias in vivo. ^2,3 La próstata se desarrolla a partir de un Anlagen embrionario denominado el seno urogenital (UGS), y antes de que el día embrionario 17 (E17 ratón ; día E18 en la rata) el UGS se pueden quitar y divididos físicamente en el epitelio (UGSE) y el mesénquima (UGSM) ⁴ Este enfoque recombinación tejido ha mejorado significativamente nuestra comprensión del desarrollo y la carcinogénesis de próstata, en particular.factor de crecimiento de LY y vías de señalización hormonales y las relaciones moleculares entre la próstata estroma y el epitelio. ^5-8 Este método implica la combinación ex vivo de UGSM con tallo o células epiteliales de las mismas o distintas especies y estos recombinantes celulares / tejido se implantan y se cultivaron y xenoinjertos en ratón huésped. ^4,9 Después de un período de crecimiento in vivo, el implante contiene próstata estructuras glandulares epiteliales incrustados en el tejido del estroma. Además tinción puede llevarse a cabo para determinar si tales estructuras son verdaderamente prostática y de origen humano. ^10,11

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Chicago Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, números de protocolo 72066 y 72231). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. La madre de embriones humanos línea celular WA01 (H1; NIH-registro # 0043) fue adquirido de WiCell (Madison, WI) y se cultivaron usando el protocolo de alimentación independiente con mTeSR1 medios (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). Las células ES se utilizaron dentro de los diez pasajes de descongelación.

1. El aislamiento del seno urogenital de ratón o rata embriones

1. La eutanasia a un ratón temporizada embarazadas (17,5 días) o la rata (18,5 días) por inhalación de CO ₂ durante 5 min. La muerte se confirma por el cese de los signos vitales en la rata. A continuación, cortar la cabeza humana. El ra es la eutanasia en este punto. Pulverizar etanol al 70% para esterilizar la piel del abdomen y los flancos. Cortar la piel del abdomen y las capas de músculo y luego se corta el útero, separe los embriones de rata de la bolsa amniótica, y cortar el cordón umbilical. La transferencia de los embriones en un tubo Falcon de 50 ml que contenía solución salina equilibrada de Hank enfriada en hielo (HBSS) y mantener en hielo. Los fetos son sacrificados por decapitación con tijeras quirúrgicas.
2. Coloque el embrión en 100 mm de placa de Petri. Biseccionar el embrión con las tijeras en el nivel del ombligo (Figura 1A). Retire el estómago y el intestino delgado. Revelar los ovarios en el embrión femenino y testículos en el embrión masculino (Figura 1B y 1C). (Los ovarios están ubicados en los polos caudal de los riñones. Los testículos son aproximadamente al nivel de la vejiga). En esta etapa de desarrollo, aislado UGSM de ambos embriones macho y hembra son capaces de inducir un linaje epitelial prostática en presencia de anfitrióntestosterona. ⁴ Después de este punto en el tiempo de desarrollo, sin embargo, las yemas prostáticas comenzar a formar en el UGSM, y el aislamiento de UGSM puro es muy difícil. ⁴
3. Bajo el microscopio de disección, corte de la pared abdominal en la línea media con unas tijeras Vannas para exponer la vejiga y de la pared posterior del abdomen. Libre el tracto genital superior de los apegos (embriones masculinos, cortó el uréter, el conducto de Wolff y de Müller conducto, en los embriones femeninos, corte el uréter y conductos de Müller). Libera la vejiga del cordón umbilical. Cortar hueso púbico y sin rodeos separada de la pared anterior del seno urogenital con pinzas de punta fina Dumont. Por último, separar la pared posterior del seno urogenital del recto. Cortar el seno urogenital con la vejiga en el extremo inferior (de la uretra) y almacenar el seno urogenital en bloque (con la vejiga) en HBSS frío de hielo.

2. La separación del mesénquima seno urogenital

1. Quite la vejiga del seno urogenital bajo el microscopio de disección (Figura 1D).
2. Transferir el seno urogenital a un tubo Falcon que contiene 1% de tripsina en calcio (Ca ^{2 +)} y magnesio (Mg ^{2 +)} HBSS libre. Colocar el tubo en un refrigerador a 4 º C durante 75 min.
3. Retire la tripsina y neutralizar tripsinización con 10% de suero de Bovin fetal (FBS) en medio DMEM/F12.
4. El pelo con cuidado el manguito mesenquimal pegajosa del tubo epitelial con una aguja o Dumont fórceps de punta fina (manteniendo el tubo epitelial intacta reduce las posibilidades de contaminación de células epiteliales del mesénquima, lo que puede resultar en la formación de las glándulas de roedores, junto con su tallo derivado de células humana epitelio glandular) (Figura 1D). ¹²
5. Transferencia UGSM en un nuevo tubo Falcon que contiene medio DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep; 0,5 mg / ml) + 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), además de 1 nM R1881. Plas el tubo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante la noche.
6. Se centrifuga el tejido a 200 xg y descartar el sobrenadante. Lavar con tampón fosfato salino (PBS) (no perturbar el sedimento de tejido).
7. Añadir 0,2% de colagenasa (en DMEM/F12) para volver a suspender el tejido. Incubar en 37 ° C con agitación suave durante 1 hora.
8. Vórtice vigorosamente el tejido digestión tres veces hasta que se convierte mezcla homogénea de una sola célula y añadir medio DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% P / S + 1% de NEAA + 1 nM R1881 para neutralizar la colagenasa.
9. Centrifugar a 200 xg y lavar por la re-suspensión de las células UGSM en HBSS, y repetir tres veces para lavar totalmente el UGSM. Finalmente suspender las células mesenquimales en DMEM/F12 y contar las células usando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células.
10. Disociar HES células cultivadas usando el protocolo de enlace de conexión con mTeSR1 medios (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) utilizando una digestión Accutase (Millipore, Billerica, MA). Lavar las células hESdurante la fase logarítmica de su crecimiento en medio DMEM/F12 cálidos, a continuación, agregar solución Accutase 1x caliente, y se incuba a 37 ° C durante 15-20 minutos hasta que las células individuales son uniformemente disociada de colonias. Añadir la misma cantidad de 1x definido inhibidor de tripsina (Invitrogen, Grand Island, NY) para neutralizar el Accutase y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar y romper los grumos de células. Células pipeta en un tubo de centrífuga y centrifugar durante 3 minutos a 200 xg, y volver a suspender el sedimento celular en medio DMEM/F12. Centrifugar tubo durante 3 minutos a 200 xg una y separar el sobrenadante y vuelva a suspender en HBSS frío o DMEM/F12 al volumen deseado.
11. Añadir HES células con relación 1:2,5 de HES / células mesenquimales. ³ Esta será una composición celular de las células 1E ⁵ UGSM con 4E ⁴ hESCs por inyección de 10 ml (una sola rata UGS típicamente rendimientos de alrededor de ⁶ células mesenquimales 2E). Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos y después se desecha el sobrenadante. Vuelva a suspender el 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, mezclado con 25% HBSS frío para un manejo más fácil) y colocar el tubo en hielo durante la inyección cápsula sub-renal.

3. Trasplante de tejido recombinante Por debajo de la cápsula renal

1. Prepare un área quirúrgica estéril.
2. Anestesie un ratón nude atímicos macho con ip ketamina / xilazina, el uso de una mezcla fresca que contiene una proporción de 01:01:08 ketamina: xilazina: solución salina. La dosificación será 100 mg / kg de ketamina y 2,5 mg / kg de xilazina. Los animales que no responden a un dedo del pie para los dedos deben estar totalmente bajo durante 20-30 min.
3. Quirúrgicamente preparar el ratón por el afeitado de la zona quirúrgica (si no está usando un ratón desnudo), la limpieza con tres paños alternados de alcohol al 70% seguido de solución de betadine y la aplicación de un paño quirúrgico.
4. Ponga la humedad colirio (pomada para los ojos Altalube) a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia.
5. Durante la cirugía, la tasa de respiración y la temperatura corporal central de los ratones son monitoreados. Las tasas de respiración should ser constante y mantenerse dentro de 40 a 90 respiraciones / min. La temperatura corporal central se controla con la observación del color de las membranas mucosas y las plantas de los pies de color rosa.
6. Hacer un cm de largo incisión longitudinal 1.0 en la parte posterior. Continuar para cortar la pared abdominal en una incisión longitudinal de 0,5 cm.
7. Apriete suavemente el riñón fuera del abdomen y mantener la humedad de la superficie del riñón usando gotas de solución salina estéril.
8. Suavemente perforar la cápsula renal con una aguja de jeringa de calibre 27 vacía. Una punción muy superficial es suficiente. Este será el lugar donde se inserta la aguja roma para inyectar la mezcla celular.
9. Llene una jeringa con aguja roma de calibre 28 con 10 l de la mezcla de células. Inserte lentamente la zona de punción y penetrar en el parénquima renal para llegar a un área por debajo de la cápsula renal. Inyectar 10 l de la mezcla celular para formar un bolo en el riñón por debajo de la cápsula renal. Retirada de la aguja.
10. Devuelva el riñón a la abdocavidad del terminal. Asegure la capa muscular del peritoneo con sutura de nylon 4-0.
11. Cierre de la piel, ya sea con suturas o grapas.
12. Limpiar la sangre de la piel usando solución salina estéril.

4. Analgesia postoperatoria y Monitoreo

1. Inyectar el animal con buprenorfina (0,1 mg / kg cada 12 h) o ketoprofeno (3-5 mg / kg en solución salina cada 12 h) para controlar el dolor post-operatorio, y 1 ml de 37 ° C IP solución salina para mantener caliente el animal y prevenir la deshidratación.
2. Coloque el animal en una jaula limpia y colocarlo en una almohadilla eléctrica leve.
3. Enviar a los animales de vuelta a la sala de los animales una vez que recobren el conocimiento y se mueven dentro de la jaula.
4. Observe que el animal diariamente para detectar signos inesperados de enfermedades e infecciones de los tres días siguientes. Los ratones se controlan con la observación de las actividades en jaulas incluyendo comida acceso y agua de 1 día después de la operación. Si los ratones muestran menos actividades, ketoprofeno es intraperitoneal administró de nuevo una vez al día.
5. Retire las grapas o suturas cutáneas 2 semanas después de la cirugía.
6. Tejidos xenoinjertos se pueden cosechar a las 8 semanas después de la cirugía. Los xenoinjertos se pueden obtener imágenes in vivo utilizando ultrasonido de pequeños animales (Figura 2A), y los tejidos fijos pueden ser seccionadas y teñidas para diversas proteínas mediante inmunohistoquímica (Figura 3).

Resultados

Basándose en el informe apasionante por Taylor, et al., Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo de injerto mediante el H1 de uso común (NIH-WA01 designado, genéticamente masculino) línea de células madre embrionarias humanas. ¹ Esta línea ha sido rigurosamente probado para el control de calidad y es cariotipo normal de ¹³ Cuando se cultiva adecuadamente, HES células se pueden mantener, ampliar y criopreservados en un estado indiferenciado y pluripotente mediante un método de culti...

Discusión

Tejido por medio de recombinación UGSM es una técnica muy útil para investigar el desarrollo de la próstata y los eventos moleculares que conducen a la iniciación del cáncer de próstata. El potencial inductivo de UGSM se ha utilizado en numerosas aplicaciones en la investigación de próstata, que incluyen la mejora del tumor toma de líneas celulares de próstata y tumores, el estudio de las interacciones epiteliales del estroma-, y la formación de recombinantes de próstata de especies cruzadas ^7,17-20 La prepar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	Mezclar a 1 ug/ml en etanol (1.000x stock)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strep Solution	GIBCO	15070	100x
stock Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET (clorhidrato de ketamina)	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 mg/ml; diluido 1:10 en solución salina estéril
AnaSed (xilacina)	VET-A-MIX, Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml; diluido 1:10 en solución salina estéril
Tripsina	BD Biosciences	215240
Colagenasa	Sigma	C2014
Ketoprofeno	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml; diluir 1:1.000 en solución salina estéril
Ungüento oftálmico	Altalube Altaire Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Microscopio estereoscópico	Leica		Se puede utilizar cualquier buen telescopio de disección.
Tijeras de resorte Vannas	Fine Science Tools	15001-08
Jeringa	Hamilton	84855
Aguja Hamilton, Pequeña RN, Calibre 28, 0.5 pulgadas, Punta Estilo #3 (Roma)	Hamilton	7803-02	con aguja personalizada
	Fisher Scientific	06-669-62
Almohadillas de gasa estériles	Fisher Scientific	22-415-469
Sutura de Vicryl Ethicon (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	Sutura soluble con aguja
Autoclip 9 mm Pinzas para heridas	Becton Dickenson	427631
PVP Almohadillas de preparación de yodo	Fisher Scientific	06-669-98
Tijera de disector con punta roma	Fine Science Tools	14072-10
Pinzas de punta fina Dumont	Fina Science Tools	11252-50
Portaagujas con tijera	Fine Science Tools	12002-14