Summary
प्रोस्टेट कैंसर दीक्षा, उपन्यास और अभिनव मानव मॉडल प्रणाली और दृष्टिकोण अंतर्निहित जल्द से जल्द आणविक तंत्र की सख्त जरूरत है जानने के लिए. मानव प्रोस्टेट उपकला लिए फार्म pluripotent स्टेम सेल आबादी प्रेरित करने के लिए पूर्व प्रोस्टेटिक मूत्रजननांगी साइनस mesenchyme (UGSM) की क्षमता प्रोस्टेट अनुसंधान के क्षेत्र में एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण है.
Abstract
प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में प्रगति गंभीर रूप से प्रोस्टेट रोग दीक्षा अंतर्निहित आनुवंशिक और आणविक घटनाओं को समझने की हमारी क्षमता सीमित है जो मानव व्युत्पन्न और हार्मोन भोले मॉडल प्रणाली की उपलब्धता सीमित है. कर्कटजनन मानव प्रोस्टेट के अध्ययन के लिए बेहतर मॉडल प्रणाली विकसित करने की ओर है, हम और दूसरों को, भ्रूण कृंतक प्रोस्टेट स्ट्रोमा का अनूठा समर्थक प्रोस्टेटिक प्रेरक क्षमता का लाभ ले लिया मूत्रजननांगी साइनस mesenchyme (UGSM) करार दिया है. इस तरह के भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के रूप में कुछ pluripotent सेल आबादी के साथ recombined, जब UGSM एक टेस्टोस्टेरोन पर निर्भर ढंग से सामान्य मानव प्रोस्टेट epithelia के गठन को प्रेरित करता है. इस तरह एक मानव मॉडल प्रणाली की जांच और प्रयोगात्मक ठेठ कृंतक ट्रांसजेनिक अध्ययन की तुलना में एक त्वरित गति से उम्मीदवार प्रोस्टेट कैंसर का खतरा जीन की क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) आनुवंशिक संस्कृति usin में संशोधित किया जा सकता हैऊतक पुनर्संयोजन से पहले ग्राम inducible जीन अभिव्यक्ति या siRNA को तोड़े नीचे वैक्टर, इस तरह के एक मॉडल जीन के कार्य परिणामों का परीक्षण करने की सुविधा, या बढ़ावा देने या कर्कटजनन को रोकने के लिए लगा रहे हैं जो जीनों के संयोजन,.
UGSM कोशिकाओं का शुद्ध आबादी को अलग करने की तकनीक, तथापि, चुनौती दे रहा है और अक्सर सीखने पिछले विशेषज्ञता के साथ किसी को व्यक्तिगत रूप से सिखाने की आवश्यकता है. इसके अलावा, एक immunocompromised मेजबान के गुर्दे कैप्सूल के तहत सेल मिश्रण का टीका तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यहाँ हम रूपरेखा और कृंतक भ्रूण और मानव प्रोस्टेट उपकला फार्म करने के लिए ऊतक के मिश्रण के गुर्दे कैप्सूल आरोपण से UGSM की उचित अलगाव को वर्णन. इस तरह के एक दृष्टिकोण, अपने वर्तमान स्तर पर, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की xenografting vivo में की आवश्यकता है, भविष्य अनुप्रयोगों संभावित इन विट्रो ग्रंथि गठन या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल आबादी (iPSCs) के उपयोग में शामिल हो सकते हैं.
Introduction
प्रोस्टेट कैंसर का बेहतर मानव मॉडल प्रणाली के लिए एक जबरदस्त जरूरत है. विशेष रूप से, आनुवंशिक रूप से सीधे प्रोस्टेट कैंसर की दीक्षा में विशिष्ट जीन की भूमिका का विचार करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है, जो सामान्य, गैर घातक प्रोस्टेट ऊतकों की प्रासंगिक मानव मॉडल प्रणाली अविश्वसनीय जानकारीपूर्ण किया जाएगा. जीनोमिक युग के आगमन के कैंसर के गठन में एक भूमिका हो सकती है जो कई जीनों की पहचान की है. प्रयोगात्मक मानव मॉडल प्रणाली की कमी है, तथापि, गंभीर रूप से कार्यात्मक परीक्षण और उम्मीदवार प्रोस्टेट कैंसर का खतरा जीन चिह्नित करने के लिए हमारी क्षमता impairs. एक आदर्श मॉडल प्रणाली उपयुक्त ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडल प्रणाली के साथ संयोजन में कैंसर का खतरा जीन का तेजी से और अधिक तेजी से कार्यात्मक विश्लेषण में सुविधा होगी. इसके अलावा, इस तरह एक मानव मॉडल प्रणाली के लिए उपन्यास उपचार की खोज और मान्यता की ओर कर्कटजनन प्रोस्टेट की संकेतन तंत्र की आणविक लक्षण वर्णन सक्षम होगाप्रोस्टेट कैंसर के गठन को रोकने.
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) xenografts के रूप में मानव प्रोस्टेट ऊतकों बनाने में सक्षम हैं. 2006 में टेलर, एट अल. HESCs के 8-12 सप्ताह की समय अवधि के भीतर कृंतक मूत्रजननांगी साइनस mesenchyme (UGSM) के साथ फिर से जब संयुक्त विवो में प्रोस्टेटिक epithelia फार्म करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है की सूचना दी. 1 इन अध्ययनों द्वारा पिछले काम पर आधारित थे कि कृंतक भ्रूण UGSM दिखा कुन्हा प्रयोगशाला 2,3 प्रोस्टेट मूत्रजननांगी साइनस (यूजीएस) करार दिया एक भ्रूण ANLAGEN से विकसित करता है. स्टेम कोशिकाओं और इन विवो में भ्रूण उपकला सेल आबादी के प्रोस्टेटिक भेदभाव को बढ़ावा देने, और पूर्व भ्रूण दिन 17 को (माउस E17 कर सकते हैं ; चूहे में दिन E18) यूजीएस हटा दिया है और शारीरिक रूप से विभाजित उपकला (UGSE) में और mesenchyme (UGSM) 4 यह ऊतक पुनर्संयोजन दृष्टिकोण काफी प्रोस्टेट विकास और carcinogenesis, विशेष रूप से हमारी समझ में इजाफा किया जा सकता है.ly वृद्धि कारक और हार्मोनल संकेत दे रास्ते और प्रोस्टेट स्ट्रोमा और उपकला के बीच आणविक रिश्तों. 5-8 इस विधि स्टेम या एक ही है या अलग प्रजातियों से उपकला कोशिकाओं के साथ UGSM के पूर्व vivo संयोजन शामिल है और इन सेलुलर / ऊतक रिकोम्बिनेंट्स प्रत्यारोपित और बड़े हो रहे हैं और माउस मेजबान भीतर xenografts. 4,9 विवो विकास में की अवधि के बाद, प्रत्यारोपण स्ट्रोमल ऊतक में एम्बेडेड प्रोस्टेट उपकला ग्रंथियों संरचनाओं में शामिल है. इसके अलावा धुंधला ऐसी संरचनाओं वास्तव में प्रोस्टेट और मानव मूल के हैं या नहीं यह निर्धारित करने के लिए आयोजित किया जा सकता है. 10,11
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Protocol
इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किया गया था. प्रोटोकॉल शिकागो संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC, प्रोटोकॉल संख्या 72066 और 72231) द्वारा अनुमोदित किया गया था. सभी शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण के तहत किया गया था, और सभी प्रयासों पीड़ित को कम से कम करने के लिए किए गए थे. मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन WA01 (एच 1, एनआईएच पंजीकरण # 0043) mTeSR1 मीडिया का उपयोग फीडर स्वतंत्र प्रोटोकॉल का उपयोग WiCell (मैडिसन, WI) और सुसंस्कृत से अधिग्रहण कर लिया था (सेल टेक्नोलॉजीज स्टेम, वैंकूवर, ई.पू.). ES कोशिकाओं विगलन का दस अंश के भीतर इस्तेमाल किया गया.
1. माउस या चूहा भ्रूण से Urogenital साइनस का अलगाव
- 5 मिनट के लिए सीओ 2 की साँस लेना द्वारा एक समय पर गर्भवती माउस दिन (17.5) या चूहा दिन (18.5) euthanize. मौत चूहे के महत्वपूर्ण संकेत के समापन से इसकी पुष्टि की है. तो नम्रता से अपनी गर्दन तोड़. रपर इस बिंदु पर euthanized है. पेट की त्वचा और flanks बाँझ 70% इथेनॉल स्प्रे. पेट की त्वचा और मांसपेशियों की परतों में कटौती और फिर, गर्भाशय कटौती एमनियोटिक थैली से चूहे के भ्रूण को अलग, और गर्भनाल काट दिया. बर्फ ठंड हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) युक्त एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में भ्रूण स्थानांतरण और बर्फ पर रख. भ्रूण शल्य कैंची के साथ कत्ल के द्वारा euthanized हैं.
- 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण रखें. नाभि (चित्रा 1 ए) के स्तर पर कैंची से भ्रूण दोटूक. पेट और छोटी आंत निकालें. पुरुष भ्रूण (चित्रा 1 बी और 1 सी) में महिला भ्रूण और वृषण में अंडाशय प्रकट करते हैं. (अंडाशय गुर्दे की दुम ध्रुवों पर स्थित हैं. वृषण लगभग मूत्राशय के स्तर पर हैं). इस विकास के चरण में, UGSM दोनों नर और मादा भ्रूण मेजबान की उपस्थिति में एक प्रोस्टेटिक उपकला वंश उत्प्रेरण के लिए सक्षम हैं से अलग कियाटेस्टोस्टेरोन. 4 इस विकास समय बिंदु के बाद, हालांकि, प्रोस्टेटिक कलियों UGSM में बनाने से शुरू, और शुद्ध UGSM का अलगाव बहुत चुनौतीपूर्ण है. 4
- विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, मूत्राशय और पेट के पीछे की दीवार को बेनकाब करने Vannas कैंची के साथ बीच लाइन में पेट की दीवार में कटौती. अनुलग्नकों से मुक्त ऊपरी जननांग पथ (नर भ्रूण में, मूत्रनली, Wolffian वाहिनी और Müllerian वाहिनी कटौती, महिला भ्रूण में, मूत्रवाहिनी और Müllerian वाहिनी कटौती). गर्भनाल से मूत्राशय नि: शुल्क. जघन हड्डी और ड्यूमॉन्ट ठीक टिप संदंश के साथ मूत्रजननांगी साइनस के पूर्वकाल दीवार से दो टूक अलग काटें. अंत में, मलाशय से मूत्रजननांगी साइनस के पीछे की दीवार को अलग. निचले अंत (मूत्रमार्ग से) में मूत्राशय के साथ मूत्रजननांगी साइनस कट और बर्फ के ठंडे HBSS में मूत्रजननांगी साइनस सामूहिक (मूत्राशय) के साथ दुकान.
2. Urogenital साइनस mesenchyme के पृथक्करण
- 1% कैल्शियम में trypsin (सीए 2 +) और मैग्नीशियम (2 मिलीग्राम +) मुक्त HBSS युक्त एक बाज़ ट्यूब मूत्रजननांगी साइनस स्थानांतरण. 75 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में ट्यूब रखें.
- Trypsin निकालें और DMEM/F12 मध्यम में 10% भ्रूण Bovin सीरम (FBS) के साथ trypsinization बेअसर.
- यह अपने स्टेम सेल व्युत्पन्न मानव के साथ बनाने कृंतक ग्रंथियों में परिणाम कर सकते हैं, ध्यान से एक सुई या ड्यूमॉन्ट ठीक टिप संदंश (बरकरार उपकला ट्यूब mesenchyme के उपकला सेल संदूषण की संभावना को कम बनाए रखने के साथ उपकला ट्यूब से चिपचिपा mesenchymal आस्तीन तंग ग्रंथियों के उपकला) (चित्रा -1). 12
- DMEM/F12 मध्यम + युक्त एक नया फाल्कन ट्यूब में UGSM स्थानांतरण 10% FBS + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep, 0.5 मिलीग्राम / एमएल) 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) प्लस 1Nm R1881. Plइक्का 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में ट्यूब 5% सीओ 2 रातोंरात साथ.
- 200 XG पर ऊतक अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) (ऊतक गोली परेशान नहीं है) के साथ धोएं.
- फिर से निलंबित ऊतकों को 0.2% collagenase (DMEM/F12 में) जोड़ें. 1 घंटे के लिए कोमल कमाल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में सेते हैं.
- सख्ती भंवर पाचन ऊतक तीन बार यह समरूप एकल कक्ष मिश्रण हो जाता है और DMEM/F12 मध्यम + जोड़ने जब तक 10% FBS + 1% पी / एस + 1% NEAA + collagenase बेअसर करने 1Nm R1881.
- 200 XG पर अपकेंद्रित्र और फिर HBSS में UGSM कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके धो लें और पूरी तरह से UGSM धोने के लिए तीन बार दोहराएँ. अंत में DMEM/F12 में mesenchymal कोशिकाओं को निलंबित और एक hemocytometer या सेल गिनती डिवाइस का उपयोग कोशिकाओं गिनती.
- एक Accutase पाचन (; Billerica, एमए Millipore) का उपयोग कर, HES कोशिकाओं mTeSR1 मीडिया (वैंकूवर, ई.पू. स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) के साथ सुसंस्कृत उपयोग कर फीडर से मुक्त प्रोटोकॉल अलग कर देना. HES कोशिकाओं को धो लेंगर्म DMEM/F12 मीडिया में उनके विकास के लॉग चरण के दौरान, तो गर्म 1x Accutase समाधान जोड़ने, और एकल कक्षों कालोनियों से समान रूप से अलग हैं जब तक 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. Accutase बेअसर और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे सेल clumps और मिश्रण को तोड़ने के लिए, 1x परिभाषित trypsin अवरोध करनेवाला (ग्रांड द्वीप, NY Invitrogen) के बराबर राशि जोड़ें. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और 3 200 XG पर मिनट, और DMEM/F12 मीडिया में फिर से निलंबित सेल गोली के लिए अपकेंद्रित्र में पिपेट कोशिकाओं. 200 फिर XG पर 3 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने, तो वांछित मात्रा में ठंड HBSS या DMEM/F12 में फिर से निलंबित.
- Hes / mesenchymal कोशिकाओं की 1:2.5 अनुपात के साथ HES कोशिकाओं जोड़ें. 3 यह 10 मिलीग्राम प्रति इंजेक्शन 4E 4 hESCs (एक भी चूहा 2 ई 6 mesenchymal कोशिकाओं के बारे में आम तौर पर पैदावार यूजीएस) के साथ 1E 5 UGSM कोशिकाओं की एक सेलुलर संरचना हो जाएगा. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 75% Matrigel (बी.डी. बायोसाइंसेज के साथ पुनः निलंबित,सैन जोस, CA, आसान से निपटने के लिए 25% ठंड HBSS के साथ मिश्रित) और उप गुर्दे कैप्सूल इंजेक्शन के लिए बर्फ में ट्यूब जगह.
3. गुर्दे कैप्सूल नीचे संयोजक ऊतक का ट्रांसप्लांटेशन
- एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार.
- Xylazine / ketamine के आईपी के साथ एक पुरुष athymic नग्न माउस anesthetize, ketamine के एक 01:01:08 अनुपात युक्त एक ताजा मिश्रण का उपयोग करें: xylazine: खारा. खुराक 100 मिलीग्राम / किग्रा Ketamine और 2.5 मिलीग्राम / किग्रा Xylazine हो जाएगा. एक पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए अनुत्तरदायी पशु पूरी तरह से 20-30 मिनट के तहत किया जाना चाहिए.
- शल्य चिकित्सा betadine समाधान द्वारा पीछा 70% शराब की तीन बारी पोंछे के साथ सफाई और एक शल्य कपड़ा लागू करने, शल्य साइट (एक नग्न माउस का उपयोग नहीं अगर) शेविंग द्वारा माउस तैयार करते हैं.
- संज्ञाहरण के दौरान सुखाने को रोकने के लिए माउस की आंखों में आंख नमी साल्वे (Altalube आँख मरहम) रखो.
- सर्जरी के दौरान, चूहों की श्वसन दर और मुख्य शरीर के तापमान पर नजर रखी जाती है. श्वसन दरों थानेदारuld स्थिर और 40-90 साँस / मिनट के भीतर बनाए रखा हो. कोर शरीर का तापमान श्लेष्मा झिल्ली का रंग और पैर की गुलाबी तलवों के अवलोकन के साथ नजर रखी है.
- पीठ पर एक 1.0 सेमी लंबे अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा. एक 0.5 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा में पेट की दीवार में कटौती करने के लिए आगे बढ़ें.
- धीरे पेट से बाहर गुर्दे निचोड़ और बाँझ खारा की बूंदों का उपयोग कर गुर्दे की सतह नम रखने के लिए.
- धीरे पंचर एक खाली 27 गेज सिरिंज सुई का उपयोग गुर्दे कैप्सूल. एक बहुत उथले पंचर पर्याप्त है. आप अपने मोबाइल मिश्रण इंजेक्षन करने के लिए अपने कुंद सुई डालने जहां यह हो जाएगा.
- अपने सेल मिश्रण की 10 μl के साथ एक 28 गेज कुंद सिरिंज सुई भरें. धीरे धीरे पंचर साइट डालने और गुर्दे कैप्सूल के नीचे एक क्षेत्र तक पहुँचने के लिए गुर्दे पैरेन्काइमा घुसना. गुर्दे कैप्सूल नीचे गुर्दे पर एक सांस में फार्म के लिए सेलुलर मिश्रण के 10 μl इंजेक्षन. आहरण सुई.
- Abdo को गुर्दा लौटेंमीनल गुहा. 4-0 नायलॉन sutures के साथ पेरिटोनियम की पेशी परत को सुरक्षित करो.
- सीवन या प्रधान या तो साथ त्वचा को बंद करें.
- बाँझ खारा का उपयोग कर त्वचा से रक्त साफ करें.
4. पोस्ट ऑपरेटिव analgesia और निगरानी
- पोस्ट ऑपरेटिव दर्द, और 37 के 1 मिलीलीटर पशु गर्म रखने के लिए डिग्री सेल्सियस खारा आईपी प्रबंधन करने के लिए buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा हर 12 घंटे) या ketoprofen (खारा हर 12 घंटे में 3-5 मिग्रा / किग्रा) के साथ पशु इंजेक्षन और निर्जलीकरण को रोकने के.
- एक साफ पिंजरे में जानवर रखो और एक हल्के हीटिंग पैड पर जगह है.
- वे होश में आने और पिंजरे के भीतर बढ़ रहे हैं एक बार पशु कमरे में वापस जानवरों भेजें.
- निम्नलिखित तीन दिनों के लिए बीमारी और संक्रमण के अप्रत्याशित लक्षण के लिए दैनिक जानवर पर गौर करें. चूहों तक पहुँचने भोजन और पानी के बाद operatively 1 दिन सहित पिंजरों में गतिविधियों के अवलोकन के साथ निगरानी कर रहे हैं. चूहों कम गतिविधियों को प्रदर्शित करते हैं, तो ketoprofen intraperitoneally के विज्ञापनएक दिन में एक बार फिर से ministered.
- त्वचा स्टेपल या टांके 2 सप्ताह के बाद सर्जरी निकालें.
- Xenograft ऊतकों 8 सप्ताह के बाद सर्जरी के रूप में जल्दी के रूप में काटा जा सकता है. Xenografts छोटे जानवर अल्ट्रासाउंड (2A चित्रा), और निश्चित ऊतकों sectioned और immunohistochemistry (चित्रा 3) का उपयोग विभिन्न प्रोटीन के लिए दाग हो सकता है का उपयोग vivo में imaged किया जा सकता है.
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Representative Results
टेलर, एट अल. द्वारा रोमांचक रिपोर्ट पर बिल्डिंग, हमारी प्रयोगशाला में आमतौर पर इस्तेमाल एच 1 (एनआईएच नामित WA01, आनुवंशिक रूप से पुरुष) मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन. 1 इस लाइन का कड़ाई से गुणवत्ता नियंत्रण के लिए परीक्षण किया गया है और का उपयोग कर एक engrafting प्रोटोकॉल विकसित की है karyotypically सामान्य है 13 उचित सुसंस्कृत, जब HES कोशिकाओं का विस्तार, बनाए रखा, और एक फीडर से मुक्त संस्कृति विधि (स्टेम सेल टेक्नोलॉजी के माध्यम से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फीडर से मुक्त प्रणाली, वैंकूवर ई.पू.) का उपयोग कर एक undifferentiated और pluripotent राज्य में cryopreserved किया जा सकता है.. 14 हमारा प्रोटोकॉल E18 चूहा UGSM की एकल कक्ष निलंबन के साथ संयुक्त और वयस्क पुरुष immunocompromised चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत इंजेक्शन hESCs के एकल कक्ष निलंबन कार्यरत हैं. HESCs UGSM प्रपत्र बड़े teratomas (चित्रा 2 बी) के बिना प्रत्यारोपित जबकि महत्वपूर्ण नियंत्रण के रूप में, USGM, कोई प्रत्यक्ष विकास पैदावार अकेले प्रत्यारोपित. 15 हमारे अनुभव, प्रत्यारोपण में, चूहे उपकला कोशिकाओं ऊतक वृद्धि में कभी नहीं परिणामों contaminating बिना UGSM की व्यावहारिक जबकि UGSM से अधिक समय के 80% से अधिक मजबूत विकास (1 मिमी से 5 मिमी से 8 सप्ताह के आकार सीमा के बाद, ऊतक के 80% से अधिक के साथ में hESCs के परिणाम की पुनर्संयोजन ) ग्रंथियों के उपकला युक्त. HESCs और UGSM दोनों युक्त रिकोम्बिनेंट्स में, जल्दी ग्रंथियों के गठन के 4 सप्ताह के बाद मनाया जाता है, और 8 सप्ताह के लिए पूरी तरह से गठन के बाद, प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) पॉजिटिव मानव प्रोस्टेट उपकला (चित्रा 3) का गठन किया है. इन ग्रंथियों एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर) पॉजिटिव मेजबान बंध्याकरण के बाद एक सप्ताह में मौजूद नहीं हैं जो luminal-स्रावी कोशिकाओं के होते हैं. महत्वपूर्ण बात, इन ग्रंथियों मानव विशिष्ट और प्रोस्टेट विशिष्ट प्रोटीन पीएसए के लिए सकारात्मक हैं. ऐसे मानव ग्रंथियों वे एक प्रोस्टेट कैंसर विशिष्ट मार्कर है, जो अल्फा methylacyl-सीओए racemase (AMACR), व्यक्त नहीं करते हैं क्योंकि गैर घातक हो दिखाई देते हैं कि आगे धुंधला दस्तावेजों. 16
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चित्रा 1. एक E18.5 चूहा भ्रूण से Urogenital साइनस का अलगाव. ए E18.5 चूहा भ्रूण. सफेद ठोस लाइन भ्रूण दोटूक की स्थिति को इंगित करता है. बी E18.5 नर चूहे भ्रूण. काला बिंदीदार लाइनों मूत्राशय, मूत्रजननांगी साइनस, मलाशय, और विकासशील वृषण संकेत मिलता है. सी. E18.5 महिला चूहा भ्रूण. काला बिंदीदार लाइनों मूत्राशय, मूत्रजननांगी साइनस और गर्भाशय का संकेत मिलता है. डी. मूत्राशय और E18.5 चूहा भ्रूण से हटा मूत्रजननांगी साइनस. जबकि ठोस लाइन मूत्राशय को दूर करने की स्थिति को दर्शाता है. काला बिंदीदार रेखा और सफेद तीर उपकला ट्यूब संकेत मिलता है. सफेद तीर सिर मूत्रजननांगी साइनस mesenchyme इंगित करता है.
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चित्रा 2. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और UGSM और hESCs से व्युत्पन्न विवो ऊतक xenografts में की सकल आकारिकी. बढ़ रही xenografts के ए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रयोग के दौरान जीवित पशु विश्लेषण अनुमति देते हैं. छवि एक Vevo 2100 छोटे जानवर अल्ट्रासाउंड (, टोरंटो, पर Visualsonics) का उपयोग 8 सप्ताह के बाद सर्जरी कब्जा कर लिया था. . परिक्रमा क्षेत्र गुर्दे की सतह पर बढ़ती ऊतक xenograft का प्रतिनिधित्व प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर बी, चूहे UGSM (rUGSM) के साथ संयुक्त HES कोशिकाओं गुर्दे की सतह (बाएं पैनल) पर एक दृश्य ऊतक जन के लिए फार्म, HES कोशिकाओं अकेले प्रत्यारोपित रूप में बड़े teratomas फार्म (मध्यम पैनल) की उम्मीद है, और अकेले प्रत्यारोपित UGSM किसी भी नमूदार संरचना (सही पैनल) के रूप में विफल रहता है.
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चित्रा 3. मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन WA01 (एच 1). ES कोशिकाओं से मानव प्रोस्टेट epithelia के गठन कृंतक UGSM साथ recombined और बरकरार पुरुष नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपित किया गया. 8 सप्ताह की वृद्धि अवधि के बाद, मानव प्रोस्टेट ग्रंथियों के उपकला ए.आर., p63, और मानव प्रतिबंधित पीएसए धुंधला द्वारा दस्तावेज के रूप में बनाई है. मेजबान बंध्याकरण के बाद एक सप्ताह, एआर पॉजिटिव, पीएसए पॉजिटिव luminal परत विशेषता एण्ड्रोजन निर्भरता दस्तावेजीकरण, मौजूद नहीं है. AMACR धुंधला की कमी के द्वारा प्रदर्शन के रूप में प्रोस्टेट ऊतकों गैर घातक हैं. इसके अलावा, ChrA पॉजिटिव neuroendocrine कोशिकाओं detectable थे. गैर घातक मानव प्रोस्टेट ऊतक ए.आर., पीएसए, और p63 के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, एक प्रोस्टेट ट्यूमर कैंसर विशिष्ट AMACR के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
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Discussion
UGSM उपयोग ऊतक पुनर्संयोजन प्रोस्टेट के विकास और प्रोस्टेट कैंसर दीक्षा के लिए अग्रणी आणविक घटनाओं की जांच के लिए एक अविश्वसनीय रूप से उपयोगी तकनीक है. UGSM के अधिष्ठापन क्षमता प्रोस्टेट अनुसंधान में कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, इनमें बढ़ाने ट्यूमर स्ट्रोमल-उपकला बातचीत का अध्ययन, और पार प्रजातियों प्रोस्टेट रिकोम्बिनेंट्स बनाने, प्रोस्टेट सेल लाइनों और ट्यूमर के ले शामिल UGSM की 7,17-20 समुचित तैयारी. , तथापि, कृंतक उपकला contaminating ग्रंथियों के गठन में परिणाम होगा और परिणाम उलझाना कर सकते हैं के रूप में प्रायोगिक सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, UGSE से UGSM की जुदाई (चरण 2.4) द्वारा अब तक प्रोटोकॉल में भी सबसे महत्वपूर्ण और सबसे मुश्किल कदम है. इस तरह के संक्रमण के लिए नियंत्रित करने के लिए, प्रजातियों के बीच विचार करने के लिए तकनीक का उपयोग दृढ़ता से प्रोत्साहित किया है, साथ ही है सूक्ष्मकोशिका से कोई ग्रंथियों के गठन के दस्तावेज़ के लिए अकेले UGSM का उपयोग कर एक अतिरिक्त प्रयोगात्मक हाथआर दूषित पदार्थों. 12
फीडर से मुक्त hes संवर्धन अभिकर्मकों और तरीकों के हाल ही के विकास के शुद्ध आबादी HES कोशिकाओं, सुसंस्कृत विस्तार और cryopreserved होने की अनुमति देते हैं. 14 इसके अलावा, lentiviral जीन डिलीवरी के विस्तार का उपयोग ब्याज की जीन के स्थिर जीनोमिक समावेश और अभिव्यक्ति की अनुमति देता है. 21,22 इन संयुक्त अग्रिम प्रोस्टेटिक भ्रूण UGSM के अधिष्ठापन क्षमता के साथ संयुक्त, शुद्ध HES संस्कृतियों के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं और ब्याज की विशेष जीन व्यक्त मानव प्रोस्टेट ग्रंथियों के vivo पीढ़ी में अनुमति होगी. इसके अलावा, इस तकनीक वयस्क मेजबान से और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम सेल लाइनों (iPSCs) के लिए उत्तरदायी होगा. 23,24 परिभाषित प्रोटीन का उपयोग करना, हम बताते हैं कि इस तरह के hESC व्युत्पन्न मानव प्रोस्टेट उपकला वयस्क के लिए बहुत ही दिखाई देते हैं मानव प्रोस्टेट epithelia, लेकिन एक वैश्विक आणविक स्तर पर होना निश्चित हैध्यान में रखा जाना चाहिए, जो जीन अभिव्यक्ति में कुछ मतभेद है. इस खाते के लिए, जांचकर्ताओं एक विस्तारित नमूना आकार का उपयोग करें और लेजर कब्जा MICRODISSECTION (LCM) आधारित वयस्क मानव ऊतकों की तुलना में उनके ऊतकों की आणविक प्रोफाइल को मान्य करने के लिए दृष्टिकोण और तुलनात्मक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्लेटफार्मों पर विचार करना चाहिए. बहरहाल, एक क्रमानुसार सुसंस्कृत और फीडर से मुक्त स्टेम सेल लाइन का उपयोग मानव प्रोस्टेट ग्रंथियों के उपकला के गठन प्रोस्टेट समारोह और कैंसर दीक्षा से संबंधित कई आणविक अध्ययन की सुविधा की क्षमता है.
हमारी तकनीक दृष्टिकोण, साथ ही सेलुलर मात्रा का अधिक सटीक नियंत्रण छँटाई lentiviral संक्रमण और प्रवाह का उपयोग सक्षम बनाता है जो UGSM और hESCs, दोनों की एकल कक्ष निलंबन का इस्तेमाल करता है. यह, हालांकि, UGSM के अधिष्ठापन क्षमता कम कर सकते हैं. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण) collagenase पाचन से पहले गैर अलग UGSM (2.5 कदम के बाद), का उपयोग करने के लिए किया गया हैऔर एक कोलेजन समाधान के भीतर ES कोशिकाओं, या एम्बेड कोशिकाओं के साथ या तो प्रत्यक्ष ऊष्मायन. 4 गुर्दे कैप्सूल के तहत इन ऊतकों प्रत्यारोपण करने के लिए, एक वैकल्पिक तकनीक गुर्दे कैप्सूल में एक चीरा बनाने के लिए किया जाएगा, शीर्ष पर गुर्दे कैप्सूल के तहत एक छोटी सी जेब बना गुर्दे की, और शारीरिक रूप से है कि जेब भीतर सेल जन जगह है. 4,20
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Disclosures
लेखकों के काम प्रस्तुत के साथ ब्याज की कोई विवाद नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
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