Summary
لكشف وهناك حاجة ماسة أقرب الآليات الجزيئية الكامنة وراء سرطان البروستاتا بدء، والرواية، والنظم المبتكرة نموذج الإنسان والنهج. إمكانات ما قبل البروستاتا البولية التناسلية الجيوب الأنفية اللحمة المتوسطة (UGSM) للحث السكان الخلايا الجذعية المحفزة لتشكيل ظهارة البروستاتا الذي يصيب الانسان هو أداة قوية في مجال البحوث التجريبية البروستاتا.
Abstract
التقدم في بحوث سرطان البروستات محدودة للغاية من قبل توافر نظم نموذج الإنسان المشتقة من هرمون والسذاجة، والتي تحد من قدرتنا على فهم الأحداث الجينية والجزيئية الكامنة وراء البروستاتا بدء المرض. نحو تطوير أنظمة أفضل نموذج لدراسة البروستاتا البشرية التسرطن، نحن وآخرون استفادوا من إمكانات استقرائي الموالية للالبروستاتا فريدة من القوارض الجنينية البروستاتا سدى، ووصف البولي التناسلي الجيوب الأنفية اللحمة المتوسطة (UGSM). عندما معاد مع بعض السكان الخلية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية، UGSM الحث على تشكيل طبيعي البروستاتا ظهائر الإنسان في الطريقة التي تعتمد على هرمون التستوستيرون. مثل هذا النظام نموذج الإنسان يمكن أن تستخدم للتحقيق وتجريبيا اختبار قدرة المرشح البروستاتا جينات القابلية السرطان بوتيرة متسارعة مقارنة مع الدراسات المعدلة وراثيا القوارض نموذجي. منذ الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) يمكن تعديلها وراثيا في الثقافة النقيبز محرض التعبير الجيني أو سيرنا تدق إلى أسفل نواقل قبل إعادة التركيب الأنسجة، ومثل هذا النموذج يسهل اختبار عواقب وظيفية من الجينات، أو مزيج من الجينات، التي يعتقد لتعزيز أو منع التسرطن.
تقنية عزل السكان نقية من خلايا UGSM، ومع ذلك، هو التحدي والتعلم وغالبا ما يتطلب شخص من ذوي الخبرة السابقة لتعليم شخصيا. وعلاوة على ذلك، يمكن تلقيح مخاليط الخلية تحت كبسولة الكلى من مضيف المناعة تكون صعبة من الناحية التقنية. نحن هنا الخطوط العريضة وتوضح العزلة السليم للUGSM من أجنة القوارض وزرع كبسولة الكلوي المخاليط الأنسجة لتشكيل ظهارة البروستاتا الذي يصيب الانسان. مثل هذا النهج، في مرحلته الحالية، يتطلب في الجسم الحي xenografting من الخلايا الجذعية الجنينية؛ التطبيقات المستقبلية المحتملة يمكن أن تشمل في المختبر تشكيل الغدة أو استخدام يسببها المحفزة السكان الخلية الجذعية (iPSCs).
Introduction
هناك حاجة هائلة للنظم أفضل نموذج الإنسان من سرطان البروستاتا. على وجه الخصوص، فإن أنظمة نموذج الإنسان ذات الصلة من العادية، الأنسجة البروستات غير الخبيث الذي يمكن التلاعب بها وراثيا لنستشف مباشرة دور جينات معينة في بدء سرطان البروستاتا يكون بشكل لا يصدق غنية بالمعلومات. وقد حددت ظهور عصر الجينوم العديد من الجينات التي قد يكون لها دور في تشكيل السرطان. الافتقار إلى نظم نموذج الإنسان التجريبية، ومع ذلك، يضعف بشدة قدرتنا على اختبار وظيفيا وتوصيف سرطان البروستاتا مرشح جينات القابلية. ومن شأن النظام النموذجي المثالي تسهيل التحليلات الفنية السريعة وأسرع من جينات القابلية سرطان في تركيبة مع أنظمة نموذج القوارض المعدلة وراثيا المناسبة. وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذا النظام نموذج الإنسان تمكين التوصيف الجزيئي للآليات يشير البروستات التسرطن نحو اكتشاف والتحقق من علاجات جديدة للمنع تكوين سرطان البروستاتا.
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هي قادرة على تشكيل أنسجة البروستاتا الإنسان كما xenografts. في عام 2006 تايلور، وآخرون. ذكرت أن hESCs يمكن أن يتسبب في تشكيل ظهائر البروستاتا في الجسم الحي عند إعادة جنبا إلى جنب مع القوارض البولي التناسلي الجيوب الأنفية اللحمة المتوسطة (UGSM) في غضون فترة زمنية من 8-12 أسابيع. 1 هذه الدراسات استندت على الأعمال السابقة من قبل يمكن للمختبر كونها تظهر أن القوارض UGSM الجنينية تعزيز التمايز البروستاتا من الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الظهارية السكان في الجسم الحي. 2،3 البروستاتا يتطور من ANLAGEN الجنينية يطلق عليه الجيب البولي التناسلي (UGS)، وقبل يوم الجنينية 17 (الماوس E17 ؛ يوم E18 في الفئران) وUGS يمكن إزالتها وتنقسم فعليا إلى ظهارة (UGSE) واللحمة المتوسطة (UGSM) 4 هذا النهج إعادة التركيب الأنسجة قد عززت بشكل كبير من فهمنا للتطور البروستات والسرطان، خاصة.عامل نمو لاي ومسارات الإشارات الهرمونية والعلاقات بين الجزيئية البروستاتا سدى وظهارة. 5-8 هذا الأسلوب ينطوي على مزيج فيفو السابقين من UGSM مع الجذعية أو خلايا الظهارية من نفس النوع أو متميزة ويتم زرع هذه recombinants الخلوية / الأنسجة ونمت وxenografts داخل المضيف الماوس. 4،9 وبعد فترة من النمو في الجسم الحي، وزرع يحتوي على هياكل غدي البروستاتا الظهارية جزءا لا يتجزأ من نسيج اللحمية. ويمكن إجراء مزيد من تلطيخ لتحديد ما إذا كانت هذه الهياكل هي البروستاتا والمنشأ الإنسان حقا. 10،11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل جامعة شيكاغو المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC، أرقام بروتوكول 72066 و72231). تم إجراء كل العمليات الجراحية تحت التخدير، وأدلى كل الجهود للحد من المعاناة. الإنسان الجنينية الخلايا الجذعية خط WA01 (H1؛ NIH تسجيل # 0043) تم الحصول عليها من معهد ويسيل (ماديسون، WI) ومثقف باستخدام بروتوكول المغذية مستقلة باستخدام mTeSR1 وسائل الإعلام (تقنيات الخلايا الجذعية؛ فانكوفر، BC). وقد استخدمت الخلايا الجذعية الجنينية في غضون عشرة مقاطع من الذوبان.
1. عزل الجيوب الأنفية البولي التناسلي من الفأر أو الجرذ الأجنة
- الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل (17.5 يوم) أو الفئران (18.5 يوم) عن طريق استنشاق CO 2 لمدة 5 دقائق. تأكيد الإعدام وقف المؤشرات الحيوية في الفئران. ثم كسر عنقه إنسانية. صفي هو الموت الرحيم في هذه المرحلة. رش الايثانول 70٪ لتعقيم الجلد في البطن والخاصرتين. قطع الجلد في منطقة البطن وطبقات العضلات ومن ثم قطع الرحم، فصل الأجنة الفئران من الكيس الذي يحيط بالجنين، وقطع الحبل السري. نقل الأجنة إلى 50 مل فالكون أنبوب يحتوي على محلول الملح المتوازن الجليد الباردة هانك (HBSS) والحفاظ على الجليد. يصرح باستخدامها الأجنة بواسطة قطع الرأس مع مقص جراحي.
- وضع الجنين في طبق بيتري 100 ملم. شطر الجنين مع مقص على مستوى السرة (الشكل 1A). إزالة المعدة والأمعاء الدقيقة. كشف المبيضين في الجنين الأنثى والخصية في الجنين ذكر (الشكل 1B و 1C). (المبيضين وتقع في القطبين الذيلية من الكليتين. الخصيتين ما يقرب على مستوى المثانة). في هذه المرحلة التنموية، معزولة UGSM من كلا أجنة من الذكور والإناث قادرون على إحداث نسب الظهارية البروستاتا في وجود المضيفةهرمون تستوستيرون. 4 بعد هذه النقطة مرة التنموية، ومع ذلك، تبدأ براعم البروستاتا تشكيل في UGSM، والعزلة من UGSM نقية هي صعبة للغاية. 4
- تحت المجهر تشريح، وقطع جدار البطن في خط الوسط مع مقص Vannas لفضح المثانة والجدار الخلفي للبطن. الحرة الجهاز التناسلي العلوي من المرفقات (في الأجنة الذكور، وقطع الحالب، قناة وولف ومولر القناة؛ في الأجنة الإناث، وقطع الحالب وقناة مولر). تحرير المثانة من الحبل السري. قطع عظم العانة ومنفصلة بصراحة من الجدار الأمامي من الجيب البولي التناسلي مع دومون غرامة ملقط غيض. وأخيرا، فصل الجدار الخلفي من الجيوب الأنفية البولي التناسلي من المستقيم. قطع الجيوب الأنفية البولي التناسلي مع المثانة في النهاية السفلي (من مجرى البول) وتخزين البولي التناسلي الجيوب الأنفية EN كتلة (مع المثانة) في الجليد الباردة HBSS.
2. فصل من اللحمة المتوسطة الجيب البولي التناسلي
- نقل الجيوب الأنفية البولي التناسلي إلى أنبوب الصقر تحتوي على 1٪ التربسين في الكالسيوم (كا 2 +) والمغنيسيوم (مغ 2 +) HBSS الحرة. وضع أنبوب في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 75 دقيقة.
- إزالة وتحييد التربسين trypsinization مع 10٪ الجنين مصل بوفين (FBS) في DMEM/F12 المتوسطة.
- ندف بعناية كم الوسيطة لزجة من أنبوب الظهارية مع إبرة أو ملقط دومون غرامة طرف (الحفاظ على أنبوب الظهارية سليمة يقلل من فرص تلوث الخلايا الظهارية من اللحمة المتوسطة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى الغدد القوارض تشكيل جنبا إلى جنب مع الجذعية المشتقة الخاص الخلية البشرية ظهارة غدي) (1D الشكل) 12
- نقل UGSM في أنبوب فالكون جديد يحتوي DMEM/F12 المتوسطة + 10٪ FBS + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا؛ 0.5 ملغ / مل) + 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، بالإضافة إلى 1nM R1881. ررالآس الأنبوب في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
- أجهزة الطرد المركزي في الأنسجة في 200 XG وتجاهل طاف. يغسل مع العازلة الفوسفات المالحة (PBS) (لا تعكير صفو بيليه الأنسجة).
- إضافة كولاجيناز 0.2٪ (في DMEM/F12) لإعادة تعليق الأنسجة. احتضان في 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف لمدة 1 ساعة.
- دوامة بقوة الأنسجة الهضم ثلاث مرات حتى يصبح الخليط متجانس وحيدة الخلية وإضافة DMEM/F12 المتوسطة + 10٪ FBS + 1٪ P / S + 1٪ + NEAA 1nM R1881 لتحييد كولاجيناز.
- الطرد المركزي في 200 x ج ثم يغسل عن طريق إعادة تعليق الخلايا UGSM في HBSS، وكرر ثلاث مرات لغسل بالكامل UGSM. تعليق وأخيرا خلايا اللحمة المتوسطة في DMEM/F12 وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو جهاز عد الخلايا.
- فصل الخلايا حس مثقف بروتوكول باستخدام تغذية خالية من وسائل الاعلام مع mTeSR1 (تقنيات الخلايا الجذعية؛ فانكوفر، BC) باستخدام الهضم Accutase (ميليبور؛ فالجهاز يبث اشعة تماثل، MA). غسل الخلايا حسخلال مرحلة السجل من نموها في الحارة DMEM/F12 وسائل الإعلام، ثم يضاف دافئ حل Accutase 1X، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى الخلايا واحد يتم فصلها بشكل موحد من المستعمرات. إضافة مبلغ مساو من 1X تعريف التربسين المانع (إينفيتروجن؛ غراند ايلاند، نيويورك) لتحييد Accutase وماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط وتفتيت كتل الخلايا. خلايا ماصة في أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 XG، وإعادة تعليق بيليه خلية في DMEM/F12 وسائل الإعلام. أجهزة الطرد المركزي أنبوب لمدة 3 دقائق في 200 XG مرة أخرى وإزالة طاف، ثم إعادة تعليق في HBSS الباردة أو DMEM/F12 في حجم المطلوب.
- إضافة الخلايا حس مع 1:2.5 نسبة من حس / خلايا اللحمة المتوسطة. وسوف 3 يكون هذا التكوين الخلوي للخلايا 1E 5 UGSM مع 4E 4 hESCs لكل 10 مل حقن (فأر واحد UGS عادة غلات حول 2E 6 خلايا اللحمة المتوسطة). الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق ثم تجاهل طاف. اعادة تعليق مع 75٪ Matrigel دينار بحريني (العلوم البيولوجية،سان خوسيه، كاليفورنيا؛ مختلطة مع 25٪ HBSS الباردة لتسهيل المناولة) ووضع أنبوب في الجليد لحقن كبسولة شبه الكلوي.
3. زرع الأنسجة المؤتلف تحت كبسولة الكلى
- تعد منطقة العمليات الجراحية المعقمة.
- تخدير الفأر عارية athymic الذكور مع الكيتامين / زيلازين الملكية الفكرية، واستخدام مزيج الطازجة التي تحتوي على نسبة 01:01:08 من الكيتامين: زيلازين: المالحة. وسوف تكون الجرعات 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 2.5 ملغ / كغ زيلازين. ينبغي أن الحيوانات لا تستجيب إلى أخمص القدمين قرصة تكون تحت بالكامل لمدة 20-30 دقيقة.
- إعداد جراحيا الماوس عن طريق حلق موقع الجراحية (إذا لم تكن تستخدم ماوس عارية)، والتطهير مع ثلاثة مناديل بالتناوب من الكحول 70٪ تليها حل بتدين وتطبيق ثنى الجراحية.
- وضع مرهم رطوبة العين (Altalube مرهم العين) للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير.
- أثناء الجراحة، ويتم رصد معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم الأساسية من الفئران. معدلات التنفس SHOيكون ULD ثابت وصيانتها ضمن 40-90 الأنفاس / دقيقة. ويتم رصد درجة حرارة الجسم الأساسية مع ملاحظة لون الأغشية المخاطية وباطن الوردي القدمين.
- جعل 1.0 سم طويلة طولية شق الجلد على ظهره. مواصلة خفض جدار البطن في 0.5 سم شق طولي.
- الضغط برفق الكلى من البطن والحفاظ على رطوبة سطح الكلى باستخدام قطرات من محلول ملحي.
- ثقب بلطف الكبسولة الكلوي باستخدام فارغة عيار 27 إبرة حقنة. ثقب ضحلة جدا كافية. وسيكون هذا حيث قمت بإدراج إبرة حادة لحقن خليط الخلوية.
- ملء 28 عيار إبرة حقنة حادة مع 10 ميكرولتر من خليط الخلوي. ببطء إدراج موقع ثقب واختراق لحمة الكلى للوصول إلى منطقة تحت كبسولة الكلى. حقن 10 ميكرولتر من خليط الخلوية لتشكيل بلعة على الكلى تحت الكبسولة الكلوي. انسحاب الإبرة.
- عودة الكلى إلى عبدهتجويف مينال. تأمين طبقة العضلات الصفاق مع خيوط النايلون 4-0.
- إغلاق الجلد مع خياطة إما أو التيلة.
- تنظيف الدم من الجلد باستخدام ملحي معقم.
4. تسكين والمراقبة اللاحقة للعمليات الجراحية
- حقن الحيوان مع البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ كل 12 ساعة) أو كيتوبروفين (3-5 ملغ / كغ في المياه المالحة كل 12 ساعة) لإدارة الألم بعد العمليات الجراحية، و 1 مل من 37 درجة مئوية IP المالحة للحفاظ على الحيوانات دافئة ومنع الجفاف.
- وضع الحيوان في قفص نظيفة ووضعه على وسادة التدفئة معتدل.
- أرسل هذه الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة الحيوان بمجرد يستعيد وعيه وتتحرك داخل القفص.
- مراقبة الحيوانات يوميا بحثا عن علامات غير متوقعة من المرض والعدوى خلال الأيام الثلاثة التالية. ويتم رصد الفئران مع مراقبة الأنشطة في أقفاص بما في ذلك الغذاء والماء الوصول 1 يوم بعد العملية. إذا كانت الفئران عرض أقل الأنشطة، كيتوبروفين هو الغشاء البريتونى إعلانخدم مرة أخرى في اليوم.
- إزالة المواد الغذائية الجلد أو الغرز 2 أسابيع بعد الجراحة.
- يمكن حصاده الأنسجة طعم أجنبي في أقرب وقت 8 أسابيع بعد الجراحة. ولا يمكن تصوير Xenografts في الجسم الحي باستخدام الموجات فوق الصوتية الحيوانات الصغيرة (الشكل 2A)، ويمكن أن تكون الأنسجة ثابت مقطوع وملطخة للبروتينات المختلفة باستخدام المناعية (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بناء على تقرير مثير من قبل تايلور، وآخرون، وقد وضعت مختبرنا بروتوكول engrafting باستخدام H1 استخداما (NIH المعين WA01، راثيا الذكور) الجنينية البشرية خط الخلايا الجذعية. 1 هذا الخط وقد تم اختبار صارم لمراقبة الجودة و أمر طبيعي karyotypically 13 عندما تربيتها بشكل مناسب، يمكن الحفاظ على الخلايا حس، وسعت، وcryopreserved في حالة غير متمايزة والمحفزة باستخدام خالية المغذية طريقة ثقافة (نظم خالية من التغذية المتاحة تجاريا فيا للتكنولوجيا الخلايا الجذعية؛ فانكوفر قبل الميلاد). لدينا 14 بروتوكول توظف تعليق خلية واحدة من hESCs جنبا إلى جنب مع تعليق خلية واحدة من E18 UGSM الفئران وحقنها تحت كبسولة الكلى من الكبار الفئران الذكور المناعة. كما الضوابط المهمة، مزروع USGM وحدها تعطي أي نمو ملحوظ، بينما hESCs مزروع دون UGSM شكل مسخي المبيض كبيرة (الشكل 2B). 15 في تجربتنا، زرع أوجه من UGSM دون تلويث الخلايا الظهارية الفئران أبدا النتائج في نمو الأنسجة، في حين إعادة التركيب من UGSM بالإضافة إلى النتائج hESCs في النمو القوي أكثر من 80٪ من الوقت (بعد 8 أسابيع أحجام تتراوح ما بين 1 مم إلى 5 مم، مع أكثر من 80٪ من النسيج تحتوي على ظهارة غدي). في recombinants تحتوي على كل من hESCs وUGSM، لوحظ في وقت مبكر تشكيل غدي بعد 4 أسابيع، وبعد 8 أسابيع من تشكيلها بالكامل، ويتم تشكيل مستضد البروستات محددة (PSA) إيجابية ظهارة البروستاتا البشرية (الشكل 3). هذه الغدد تحتوي على مستقبلات الاندروجين (AR) إيجابية الخلايا اللمعية-الإفرازية التي ليست موجودة بعد أسبوع واحد الإخصاء المضيف. الأهم من ذلك، هذه الغدد هي ايجابية للبروتين PSA الإنسان محددة والبروستات محددة. وثائق تلطيخ كذلك أن هذا الإنسان الغدد يبدو أن غير الخبيثة لأنها لا تعبر عن ألفا methylacyl، لجنة الزراعة راسيماز (AMACR)، الذي هو علامة سرطان البروستاتا محددة. 16
ether.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 1. عزل الجيوب الأنفية البولي التناسلي من جنين فأر E18.5. A. E18.5 الفئران الجنين. خط بيضاء صلبة يشير إلى موقف للشطر الجنين. B. E18.5 ذكر جنين فأر. الخطوط المنقطة السوداء تشير إلى المثانة، الجيوب الأنفية البولي التناسلي، المستقيم، والخصيتين النامية. C. E18.5 الجنين أنثى الفئران. الخطوط المنقطة السوداء تشير إلى المثانة، الجيوب الأنفية البولي التناسلي والرحم. D. المثانة والجيوب الأنفية البولي التناسلي إزالتها من جنين فأر E18.5. خط بينما الصلبة يشير إلى موقف لإزالة المثانة. الخط المنقط بالأسود والسهم الأبيض يشير إلى أنبوب الظهارية. رأس السهم الأبيض يشير إلى اللحمة المتوسطة الجيوب الأنفية البولي التناسلي.
7/50327fig2.jpg "بديل =" الشكل 2 "FO: محتوى العرض =" 4IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50327/50327fig2highres.jpg "/>
الشكل 2. التصوير بالموجات فوق الصوتية والتشكل الإجمالي من xenografts في الأنسجة الحية المستمدة من UGSM وhESCs. A. التصوير بالموجات فوق الصوتية من xenografts المتزايد تسمح تحليلات الحيوانات الحية أثناء التجربة. تم القبض صورة 8 أسابيع بعد الجراحة باستخدام الموجات فوق الصوتية VEVO 2100 حيوان صغير (Visualsonics؛ تورنتو، ON). . يمثل منطقة حلقت فوق طعم أجنبي الأنسجة تنمو على سطح الكلى B. وفي نقطة النهاية التجريبية، والخلايا حس جنبا إلى جنب مع UGSM الفئران (rUGSM) تشكيل كتلة الأنسجة مرئية على سطح الكلى (اللوحة اليسرى)؛ خلايا حس مزروع وحدها تشكيل مسخي المبيض كبيرة مثل المتوقع (لوحة الأوسط)؛ وUGSM مزروع وحده فشل في تشكيل أي بنية ملحوظ (اللوحة اليمنى).
. JPG "بديل =" الشكل 3 "FO: محتوى العرض =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50327/50327fig3highres.jpg "/>
الشكل (3). تم تشكيل معاد من الظهارة البروستاتا البشرية من الخلايا الجذعية الجنينية لاين WA01 الإنسان (H1). خلايا ES مع UGSM القوارض ومزروع تحت كبسولة الكلى سليمة من الفئران عارية من الذكور. بعد فترة نمو 8 أسابيع، ويتم تشكيل الإنسان البروستاتا ظهارة غدي كما هو موثق من قبل AR، P63، والإنسان المقيدة PSA تلطيخ. أسبوع واحد بعد الإخصاء المضيف، AR-الإيجابية، طبقة اللمعية PSA-الإيجابي هو عدم وجود توثيق مميزة الاندروجين التبعية. أنسجة البروستاتا هي غير الخبيثة كما يتضح من عدم وجود AMACR تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، كانت خلايا الغدد الصم العصبية CHRA إيجابية للكشف. تم استخدام غير الخبيثة أنسجة البروستات الإنسان كعنصر تحكم لAR، PSA، وP63؛ تم استخدام ورم البروستاتا كعنصر تحكم إيجابية لAMACR سرطان محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعادة التركيب الأنسجة باستخدام UGSM هو تقنية مفيدة للغاية لتحقيق التنمية في البروستاتا والأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى سرطان البروستاتا البدء. وقد استخدم إمكانات استقرائي من UGSM للعديد من التطبيقات في مجال البحوث البروستاتا، وهذه تشمل تعزيز الورم تأخذ من خطوط الخلايا البروستاتا والأورام، ودراسة التفاعلات اللحمية-الظهارية، وتشكيل recombinants البروستاتا عبر الأنواع 7،17-20 إعداد السليم لUGSM. ، ومع ذلك، أمر بالغ الأهمية لنجاح التجريبية كما تلويث ظهارة القوارض سيؤدي إلى تشكيل غدي ويمكن أن نخلط النتائج. وهكذا، فإن الفصل بين UGSM من UGSE (الخطوة 2.4) هو إلى حد بعيد الخطوة الأكثر صعبة الأكثر أهمية وأيضا في البروتوكول. للسيطرة على هذا التلوث، واستخدام تقنيات تمييز بين الأنواع وتشجع بقوة، فضلا عن ذراع تجريبية إضافية باستخدام UGSM وحدها إلى الوثيقة رقم تشكيل غدي من cellulaالملوثات ص 12
التطورات الأخيرة خالية من الكواشف المغذية زراعة حس وطرق تسمح مجموعات نقية الخلايا حس أن يكون مثقف وتوسيعه وcryopreserved 14 وعلاوة على ذلك، فإن التوسع في استخدام توصيل الجينات lentiviral يسمح إدماج الجيني مستقرة والتعبير عن الجينات في المصالح. 21،22 هذه التطورات مجتمعة تسمح للتلاعب الجيني من الذهب الخالص الثقافات حس، وعند دمجها مع احتمال استقرائي من UGSM الجنينية البروستاتا، وسوف تسمح في توليد المجراة من الغدد البروستاتا الإنسان التعبير عن جينات محددة من الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية تكون قابلة لليسببها-المحفزة خطوط الخلايا الجذعية (iPSCs) المستمدة من المضيفين الكبار ومن الخلايا المعدلة وراثيا. 23،24 طريق بروتينات محددة، وتبين لنا أن هذه HESC المستمدة من ظهارة البروستاتا الذي يصيب الانسان تظهر مشابهة جدا إلى الكبار الإنسان البروستاتا ظهائر، ولكن على المستوى الجزيئي العالمية هناك من المؤكد أن تكونبعض الاختلافات في التعبير الجيني التي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. لحساب هذا، ينبغي للمحققين استخدام حجم عينة موسعة والنظر تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) المستندة إلى النهج والمقارنة التعبير الجيني التحليلات منصات للتحقق من صحة محات الجزيئية من أنسجتها بالمقارنة مع الأنسجة البشرية الكبار. ومع ذلك، وتشكيل ظهارة غدية الإنسان البروستاتا باستخدام خط الخلايا الجذعية متسلسل مثقف وخالية من التغذية لديه القدرة على تسهيل العديد من الدراسات الجزيئية المتعلقة ظيفة البروستاتا وبدء السرطان.
أسلوبنا يستخدم تعليق خلية واحدة من كل UGSM وhESCs، والتي تمكن من استخدام عدوى lentiviral وتدفق الفرز النهج، وكذلك مراقبة أكثر دقة من كميات الخلوية. هذا يمكن، مع ذلك، يقلل من احتمال استقرائي من UGSM. لقد كان نهج بديل لاستخدام UGSM غير فصلها (بعد الخطوة 2.5)، قبل الهضم كولاجيناز)وإما الحضانة مباشرة مع خلايا ES، أو خلايا التضمين ضمن حل الكولاجين. 4 لزرع هذه الأنسجة تحت الكبسولة الكلوي، فإن وجود تقنية بديلة تكون إلى إجراء شق في كبسولة الكلوي، وخلق جيب صغير تحت كبسولة الكلى على رأس في الكلى، ووضع جسديا الكتلة الخلوية داخل هذا الجيب. 4،20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح مع العمل المقدم.
Acknowledgments
ونود أن ننوه بدعم من جامعة شيكاغو قسم جراحة المسالك البولية برئاسة الدكتور ارييه Shalhav، ومدير المسالك البولية بحث الدكتور كاري المتزحلق على الجليد-شيفر. ونود أيضا أن نعترف بدعم من جامعة شيكاغو المركز الشامل للسرطان (UCCCC) بقيادة الدكتور ميشيل لو بو. أيضا نحن مع أن أشكر المساعدة التقنية خبير مرفق الأنسجة البشرية مركز الموارد الأساسية بقيادة الدكتور مارك مدينة Lingen، ومساعدة من ليزلي مارتن وماري جو Fekete. ونشكر أيضا مرفق الأساسية المناعية التي يديرها تيري لي. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة شيكاغو قسم الجراحة، وقسم جراحة المسالك البولية؛ لجمعية السرطان الأمريكية منحة البحوث المؤسسية (ACS-IRG، # IRG-58-004)؛ السرطان مركز دعم المنح (P30 CA14599)، وBrinson مؤسسة؛ الصندوق ألفين باوم العائلة، وجامعة شيكاغو مجلس أبحاث السرطان مؤسسة المرأة، ويدعم S. كريغيل من قبل HHMI: ميد حيز غراد الزملاءالورك (56006772) وعلم الأحياء جرانت تدريب السرطان (T32-CA09594). وأخيرا، نود أن نشكر روبرت كلارك، والدكتور VenkateshKrishnan، وناثان Stadick لتقييمها نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
