La formación del epitelio prostático humano utilizando tejido recombinación de roedores Urogenital mesénquima seno y células madre humanas

El objetivo general de este procedimiento es aislar urogenitales de roedores, mesénquima sinusal o UGSM de embriones de roedores e implantar mezclas de tejido en la cápsula renal que pueden formar epitelio prostático humano. Esto se logra aislando primero el seno urogenital de embriones de ratón o rata. A continuación, se separa el mesénquima del seno urogenital del epitelio.

A continuación, las suspensiones unicelulares del mesénquima del seno urogenital se combinan con células madre pluripotentes. Finalmente, la mezcla de células se implanta debajo de la cápsula renal de un ratón huésped. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la formación de epitelio prostático humano en el riñón de ratón mediante la validación de la expresión de PSA específico en humanos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de la próstata y el inicio de la enfermedad, también se puede aplicar a otros sistemas, como el xenoinjerto de tumores de próstata humanos y la inducción de líneas celulares tumorogénicas semanales para formar tumores. Después de sacrificar a una rata o ratón embarazada programada y aislar los embriones, sepárelos del saco amniótico, corte el cordón umbilical y transfiéralos a un tubo de 50 mililitros que contenga madejas heladas. Equilibre la solución salina y manténgala en hielo.

Coloque un embrión en una placa de Petri de 100 milímetros y use unas tijeras para dividirlo a la altura del bolo. Se extrae el estómago y el intestino delgado y luego se localizan los ovarios en el embrión femenino, que se encuentran en los polos de los riñones o los testículos en el varón ubicados a nivel de la vejiga. Bajo un visor de disección.

Use tijeras Venice para cortar la pared abdominal para exponer la vejiga y la pared posterior del abdomen. Libera el tracto genital superior de las inserciones y libera el cordón umbilical. Cortar el hueso púbico y con pinzas de punta fina dumont.

Sin rodeos, sepáralo de la pared anterior del seno urogenital. Separe la pared posterior del seno urogenital del recto y corte el seno urogenital con la vejiga en el extremo inferior. A continuación, separe la vejiga del seno urogenital.

Almacene el seno urogenital y bloquee en HBSS helado. Transfiera el seno urogenital a un tubo de 50 mililitros que contenga 1% de tripsina en HBSS sin calcio ni magnesio e incube a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, retire la tripsina y agregue 10%FBS y DM A MF 12 medio para neutralizar la digestión.

A continuación, use una aguja o pinzas de punta fina para separar cuidadosamente la manga mesenquimal pegajosa del tubo epitelial. Mantener el tubo epitelial intacto reduce las posibilidades de contaminación de las células epiteliales del mesénquima. Esto puede dar lugar a la formación de glándulas de roedores junto con el epitelio glandular humano derivado de las células madre.

Transfiera el UGSM a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga DMM F 12, medio que contenga 10 % de FBS, 1 % de estreptococo en pluma, 1 % de aminoácidos no esenciales y un nanomolar. R 1 8 81 Incubar el tubo a 37 grados centígrados con 5%CO2 durante toda la noche. Al día siguiente, centrifugar el tejido a 200 G. Deseche el sobrenadante y use PBS para lavar el pellet.

Después de eliminar el PBS, vuelva a suspender el tejido en colagenasa al 0,2% en D-M-A-M-F 12 e incube a 37 grados centígrados con un balanceo suave durante una hora, vórtice vigorosamente el tejido de digestión tres veces hasta que se convierta en una mezcla unicelular homogénea y neutralice la colagenasa agregando medio D-M-A-M-F 12 con 10%FBS, 1% estreptococo en pluma, 1% aminoácidos no esenciales y un nanomolar R 1 8 81. Lavar las celdas tres veces granulándolas a 200 G y Resus suspendiéndolas en HBSS. Por último, resus, suspender las células mesenquimales en DMM F 12 y utilizar un hemocitómetro para contarlas y realizar el trasplante.

Después de preparar un área quirúrgica estéril y anestesiar a un ratón desnudo atímico masculino con una inyección IP de ketamina xilacina, de acuerdo con el protocolo de texto, realice un pellizco en el dedo del pie para confirmar el nivel de sedación, prepare quirúrgicamente al ratón afeitando el sitio quirúrgico si es necesario y limpiándolo con tres toallitas alternas de alcohol al 70% seguidas de una solución de Betadine. Después de aplicar el ungüento para los ojos, haga una incisión longitudinal de un centímetro en la espalda y continúe cortando la pared abdominal con una incisión longitudinal de 0,5 centímetros. Exprima suavemente el riñón del abdomen y use gotas de solución salina estéril para mantenerlo húmedo.

A continuación, con una aguja de jeringa de calibre 27, perfore suavemente la cápsula renal para crear un lugar de inyección para la mezcla de células. A continuación, llene una aguja de jeringa de calibre 28 con 10 microlitros de mezcla de células e insértela lentamente en el lugar de la punción, penetrando en el parénquima renal. Para llegar a un área debajo de la cápsula renal.

Inyecte 10 microlitros de la mezcla celular para formar un bolo en el riñón debajo de la cápsula renal y retire la aguja. Regrese el riñón a la cavidad abdominal y asegure la capa muscular del peritoneo con cuatro suturas de nylon. Cierre la piel con suturas o grapas y use solución salina estéril para limpiar la sangre de la piel.

Aquí se muestra una imagen de ultrasonido de un xenoinjerto en crecimiento ocho semanas después de la implantación. El área encerrada en un círculo representa el xenoinjerto en la superficie del riñón. Estas imágenes muestran el crecimiento de xenoinjertos en la superficie del riñón.

Después de 12 semanas, las células madre embrionarias humanas implantadas en ausencia de mesénquima urogenital formarán un gran teratoma, mientras que el mesénquima del seno urogenital implantado solo no formará ninguna estructura discernible. Se muestra en el centro. Los paneles de esta figura son tinciones inmunohistoquímicas representativas del epitelio prostático humano derivado de células madre en comparación con el tejido prostático humano adulto.

Como se muestra aquí a la izquierda, las glándulas contienen una capa epitelial luminal AR positiva. Eso también es PSA positivo, una capa de células epiteliales basales P 63 positivas y cromogranina rara. A las células neuroendocrinas, las glándulas no son cancerosas como lo demuestra la tinción negativa de A-M-A-C-R tras la castración del huésped.

Las células luminales positivas para AR PSA ya no están presentes, lo que demuestra una dependencia característica de los andrógenos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener mucho cuidado al separar el mesénquima del seno urogenital del epitelio. Como contaminante, el epitelio del seno urogenital formará glándulas y potencialmente confundirá sus resultados.