Summary
압력 myography에서 혈관의 손상 작은 세그먼트는 두 개의 작은 캐 뉼러에 장착하고 적절한 내강 압력으로 가압. 여기, 우리는 마우스 3의 혈관 이완 반응을 측정하는 방법을 설명
Abstract
압력 myograph 시스템은 작은 동맥의 기능 평가에 절묘하게 유용에 적합한 전층 압력으로 가압. 압력 myography에서 달성 근처 생리적 조건은 혈관 침대의 생체 내 행동을 추정 할 수있는 약물 및 생리적 자극에 고유 반응의 심도 특성을 허용합니다. 압력 myograph은 기존의 와이어 myographs에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 작은 저항 혈관 엄격하게 제어 및 생리학 관련 강내 압력에서 공부하실 수 있습니다. 여기, 우리는 아세틸 콜린에 대한 응답으로 혈관 이완에 페닐와 preconstricted 3 차 주문 장간막 동맥 (긴 3-4밀리미터)의 기능을 공부합니다. 장간막 동맥은 60 mmHg로 일정한 압력으로 유지되는 압력 및 봉인 시스템에 연결된 두 개의 캐 뉼러에 장착되어 있습니다. 혈관의 루멘 및 외경 continuou 있습니다교활한는 각각 페닐 아세틸 콜린 님의 질문에 답변 혈관 수축과 혈관 이완의 실시간 정량을 허용 비디오 카메라를 사용하여 촬영.
심혈관 질환의 원인을 연구하는 압력 myography의 적용을 설명하기 위해, 우리는 전신 고혈압의 쥐 모델에서 내피 세포 의존적 혈관 기능을 평가 하였다. 수용성 구아닐산의 cyclase의 (- / - sGCα 1)의 α 1 소단위의 결핍 생쥐 때 129S6 (S6) 배경 (sGCα 1 -/-S6)에 고혈압하지만하지 않는 경우 C57BL / 6 (B6) 배경 (sGCα에 1 -/-B6). 압력 myography를 사용하여, 우리는 보여 저해하는 내피 세포 의존적 혈관 이완에 sGCα 1 결핍이 발생합니다. 혈관 장애는 sGCα 1보다 sGCα 1 -/-S6에서 더 뚜렷하다 -/-B6 마우스, 가능성 contributisGCα 1 -/-B6 마우스에 비해 sGCα 1 -/-S6의 높은 혈압 NG.
압력 myography 그로 인하여 심혈관 질환을 기본 메커니즘에 대한 우리의 통찰력을 보강, 혈관 수축과 이완에 다양한 자극의 효과를 평가하는 데 사용할 수있는 비교적 간단하지만, 민감하고 기작 유용한 기술이다.
Introduction
압력 myograph 시스템은 작은 동맥, 정맥 등 혈관의 생리적 기능과 특성을 측정하는 데 사용됩니다. 동맥이나 정맥의 손상 작은 세그먼트는 두 개의 작은 유리 캐 뉼러에 장착하고 용기 생체 특성 (그림 1과 2)에있는 그것의 대부분을 유지할 수 있도록 적절한 내강의 압력으로 가압된다. 압력 myograph에 가까운 생리적 조건은 고립 된 혈관의 고유 특성 (예를 들어, 근원 성 톤)의 조사를 허용, 혈관 침대의 생체 내 행동을 반영합니다. 근육 수축은 힘 센서 1에 직접 기계적 커플 링에 의해 평가되는 와이어 myography, 이상 압력 myography의 장점 중 일부는 반면, 혈관 시스템 개발의 전체 저항을 정의하는 마이크로 저항 동맥, 공부 할 수있는 (I) 포함 와이어 myograph 더 큰 도관 동맥, (ⅱ) t로 제한됩니다더 와이어 (ⅲ) 선박의 자연 형태가 잘 유지되는, 혈관 내강을 통과 할 필요가 없기 때문에 내피 세포를 손상하는 모자의 위험이 감소되고, (IV)는 용기 치수는 폭 넓은 범위에서 공부하실 수 있습니다 압력이나 전단 응력 2.
마이크로 혈관을 공부하는 것은 고혈압과 같은 심혈관 질환의 변형 된 혈관 톤에 기여하는 병태 생리 및 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 큰 도관 동맥을 공부하는 것보다 더 많은 정보가 될 수 있습니다. 예를 들어, 8 주 동안 쥐에게 고지방식이를 공급과 관련된 내피 세포 기능의 손상이 있지만 대동맥 고리에 2 차 주문 장간막 동맥 3 (그림 3)에서 설명 될 수있다. 압력 myography의 또 다른 장점은 가압 용기의 본질적인 근원 성 수축이 있는지, 그리고이 현상의 내피 세포의 역할과 기능을 연구 할 수있다. 여기, 우리는 DESCR장애인 산화 질소 (NO) cGMP의 신호의 설정에서 마우스 장간막 3 차 주문 저항 동맥의 혈관 반응성을 연구하는 압력 myograph의 사용을 IBE.
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Protocol
1. 용액의 조제
- 500X EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 재고 : 500 MG EDTA-나 2 • 2H 2 O의 무게를 50 ML 탈 이온수에 용해. 상온에서 보관하십시오.
- KCl을이 솔루션을 탈분극.
- 3.69 g의 NaCl, 18.64 g KCl을, 0.36 g 황산 마그네슘 무수, 0.41 g KH 2 PO 4, 0.46 g 염화칼슘 2 • 2H 2 O : K10X 재고 솔루션을 준비합니다 250 ML 탈 이온수에 용해. 상온에서 보관하십시오.
- 100 ML 최종 KCl을이 솔루션 1X를 탈분극의 경우 : 0.21 NaHCO3를, 90 ML 탈 이온수에 0.18 g의 포도당을 녹여. K10X 원액 10 ㎖를 추가합니다. 500X EDTA 용액 95 μl를 추가합니다. 잘 섞는다. 4 ° C.에 저장 일주일 이내에 사용하십시오.
- 실험의 날 (1 리터) 신선한 HEPES-PSS 솔루션을 준비합니다.
- 6.96 g의 NaCl, 0.35 g KCl을, 0.288 g 황산 마그네슘 • 7H 2 O, 0.1605 g KH 2 PO 4, 2.38 g의 HEPES. 100 ㎖에 용해탈 이온수. 플라스크 A.로 표시
- 0.312 g 염화칼슘 2 • 2H 2 O 100 ML 탈 이온수에 용해. 플라스크 B.로 표시
- 1.25 g NaHCO3를, 0.991 g 포도당. 98 ML 탈 이온수에 용해. 플라스크 C.로 표시
- 플라스크 C.이 큰 플라스크에 700 ML 탈 이온수을 가지고있는 500X EDTA 2 ㎖를 추가합니다. 연속 소용돌이로 교반 큰 플라스크에 플라스크 A, B 및 C의 내용을 붓는다. 수산화 나트륨과 7.4 산도를 조정합니다.
2. 약물 사용
- 페닐 (10 -2 M) 10 ㎖ 탈 이온수 20.37 밀리그램을 녹인다. -80에서 나누어지는 1 ML 및 저장 ° C. 직렬 실험의 날에 10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 몰 / L를 얻기 위해 희석.
- 아세틸 콜린 (10 -2 M) 10 ㎖ 탈 이온수 18.17 밀리그램을 녹인다. -80에서 나누어지는 1 ML 및 저장 ° C. 직렬 10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6을 얻기 위해 희석몰 / 실험의 날에 L.
3. 마우스
남성 WT와 sGCα 1 - / - S6와 B6 배경에 마우스는이 연구를 통해 조사 하였다. sGCα 1 - / - 기술 이전에 4,5로 생성되었다. 주택과 실험 동물 (쥐)와 관련된 절차는 매사 추세 츠 종합 병원, 보스톤, MA의 연구 동물 관리에 분과위원회에 의해 승인되었습니다.
4. 장간막 동맥의 혈관 반응성의 측정
- 와 쥐를 안락사 펜 토바 비탈 (200 ㎎ / kg, IP). 복강을 열고 장간막 조직을 해부. 분리 및 결합과 지방 조직의 무료 3 차 주문 장간막 동맥을 해부하고 얼음처럼 차가운에 HEPES-PSS 95 % O 2 / 5 %, 15 분 CO 2와 사전 평형 솔루션입니다. 동맥 배치 아니 장간막에서 분기 2 ~ 3 mm 길이의 고리를 잘라동맥. 혈관에는 혈액이 없을 때 마이크로 배 수준에서 동맥과 정맥을 구별하는 것은 문제가있다. 그것을 밖으로 해부하기 전에 여전히 동물에 그대로있는 동안 따라서, 우리는 용기를 식별하는 것이 좋습니다.
- 입구와 출구 밸브를 통해 10 ML의 주사기의 도움으로 HEPES-PSS 용액을 압력 myograph 챔버 (DMT 모델 110P & 11P 버전 1.31, 그림 2)의 유리 캐 뉼러를 입력합니다. 과도한 압력이 캐 뉼러에 연결된 깨지기 쉬운 센서를 손상시킬 수 있으므로 정맥 충만 부드럽게하고 신중하게 수행해야합니다. 작성 후 캐 뉼러 단단히 입구와 출구 밸브를 모두 닫습니다.
- 오른쪽 정맥 위에 용기의 한쪽 끝을 탑재하고주의 깊게 나일론 봉합사의 한 미세 가닥을 묶어. 주사기의 도움으로, 세척 및 흡입 밸브를 통해 HEPES 용액을 용기에 채우십시오. 가까운 용기에 왼쪽 정맥에 가져와 그것에 용기의 다른 쪽 끝을 마운트합니다. 나일론 봉합사로 묶어. 채우기챔버까지 HEPES 용액을 10 ㎖로와. 조심스럽게 주사기의 도움으로 유입 밸브를 통해 HEPES 용액을 눌러 누출을 확인합니다.
- myograph에와 비디오 카메라에 따라 챔버를 설치합니다. 챔버에서 산소와 열 (37 ° C)를 시작합니다. 밸브가 닫혀있을 때, 첫 번째 HEPES 솔루션 저수지 튜브 P1과 급수 밸브를 연결합니다. 관에는 거품이 없어 질 때까지 튜브를 통해 모든 거품과 솔루션 패스를 할 수 있습니다. 밸브를 엽니 다.
- 관 P2 압력 레귤레이터 오는 챔버의 왼쪽 밸브를 연결합니다. 모든 거품을 다시 확인합니다. 전체 시스템의 모든 거품이나 누설이 없어야합니다.
- 묘 인터페이스 패널이나 소프트웨어의 압력 메뉴로 이동 흐름을 돌리는 동안 펌프를 켭니다.
- 프로그램을 열고 COLLECT을 클릭합니다. 용기는 이제 화면 (그림 3)에서 볼 수 있어야합니다. 배는 monitori을 허용 현미경에 장착 된 카메라로 시각화NG와 혈관 내강, 혈관의 직경 및 두께 분석.
- 점차적으로 묘 인터페이스 패널이나 프로그램 P1 압력을 선택하여 P1 밸브를 통해 interluminal 압력을 높이는 다음과 같이 압력 값을 입력, 5 mmHg로 → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg로. 장력을 조정하거나 수직 또는 세로 micropositioner (그림 2)의 도움으로 따라 변형, 배는 언젠가 비틀거나 압력이 증가하면서 나선상하는 경향이있다. 60 mmHg로에서 선박 평형을 37 ° C 45 분 이상. 평형 동안 예열 HEPES 한 번 목욕 솔루션을 변경합니다.
- KCl을 탈분극 용액 10 mL를 적용, 완전히 평활근 세포를 탈분극 최대 수축을 달성하기 위해 목욕에, 37 ° C에서 prewarmed. 안정 수축 후 HEPES 용액 3 회 매 10 분에 목욕을 씻어.
- 안정과 재생산에 의해 내피 세포의 혈관 및 무결성의 가능성을 확인페닐의 추가 (10 -5 M) 및 아세틸 콜린 ible 반응 (10 -5 M). HEPES 용액 10 분 간격으로 3 번 씻어.
- (10 -5 M) 페닐 추가 선박을 preconstrict하고, 안정적인 수축을 얻을되었을 때, 아세틸 콜린의 증가 복용 (10-9, 3 × 10의 연속 추가로 누적 농도 혈관 확장 반응 곡선 (CRC)을 수행 - 9, 10 8, 3 × 10 -8, 10 7, 3 × 10 -7, 10-6, 3 × 10 -6, 10 -5 M). 마지막 투여 후, HEPES 용액으로 3 회 새로운 CRC를 시작하기 전에 매 10 분 헹구십시오.
- 2 밀리미터 EGTA을 포함하는 2 + 무료 PSS에게 CA를 적용하여 수동 내강의 직경을 결정합니다. 모든 매개 변수를 계산하는 데 사용되는 각 용량 반응 (그림 4)에 대한 기록 트레이싱 측정 루멘 직경에서.
- 퍼크로 모두 아세틸 콜린 이완 반응을 표현페닐의 preconstriction 후 내강 직경 entage 변화는 다음 방정식을 사용하여, 페닐 수축 후 칼슘이없는 직경 직경의 차이와 비교 :
- 백분율 팽창 = 100 % X [(D X - D I) / (D 캘리포니아 자유로운 - D I)], D는 측정 된 루멘 지름 및 X, I, 그리고 캘리포니아 자유로운 작용제의 각 복용량 동맥 직경을 나타냅니다 (X), 초기 직경 다음은 (I) 수축 페닐 및 CA 2 + 프리 버퍼 (CA-무료).
5. 통계 분석
모든 연속적인 측정은 평균 ± SEM을로 표현됩니다. 장간막 동맥 혈관 반응이 반복 - 조치 양방향 ANOVA로 분석된다. 모든 경우에, P는 <0.05를 통계적으로 유의 간주됩니다.
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Representative Results
NO는 중앙 인간 6 및 동물 모델 7 모두에서 혈압 항상성 유지에 관여하지 않습니다. 혈관 평활근의 이완을 제어 할 수있는 능력이 용해 구아닐산 cyclase의 (SGC), cGMP의 8 생성 헴 함유 heterodimeric 효소에 의해 매개된다. 최근에는 혈압 - 수정 유전자 변형 인간 9 혈압 조절에 SGC의 관련성을 보여주는 sGCα 1 sGCβ 1 유전자를 포함하는 현장에서 발견되었다. 흥미롭게도, SGC (sGCα 1 - / -)의 α 1 소단위의 결핍 남성 마우스는 고혈압 때 129S6 (S6) 배경 (sGCα 1 -/-S6 5)에 있지만 때 C57BL / 6 (B6) 배경 (sGCα 1 -/-B6) 4. 우리는 장간막 RESI에서 아세틸 콜린에 대한 응답으로 혈관 이완을 연구하는 압력 myography 사용/ - - S6와 B6 배경과 페닐 (그림 4)와 preconstricted에 마우스 자세 동맥 WT와 sGCα 1 일부터입니다. 그들은 궁극적 인 저항과 혈관 시스템의 적합성을 정의하기 때문에 직접 혈압을 조절하기 때문에 우리는 저항 동맥을 공부했다. sGCα 1 결핍 에 관계없이 연구 생쥐 (그림 4, 5)의 유전 적 배경, 혈관 이완을 유도하는 cetylcholine의 감소 능력과 관련되었다. / - - B6 배경에 마우스 (그림 5) 10 sGCα 1보다 S6 배경에 마우스 - / - 그러나 내피 의존 이완은 더 크게 sGCα 1에 장애가 있었다. 함께, 이러한 연구 결과는 내피 의존 이완 혈관의 감소 감도 SGC & ALPH의 변형 특정 고혈압에 기여할 수 있다는 것을, 1 - / - 생쥐.
그림 1. 회로도. 압력 myograph 챔버 (DMT)의 다양한 부분을 묘사 삽입물은 챔버 캐 뉼러에 장착 된 혈관을 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. (A) 기초와 (B) 페닐에 의한 수축에 따라 2 차 주문 마우스 장간막 동맥의 비디오 촬영시의 대표 이미지는. 외부 직경과 혈관 루멘은 각각 녹색과 빨간색 선으로 묘사된다. 오른쪽 패널의 흔적 구역 내에서 측정 된 신호의 강도를 나타냅니다EA는 외경 (녹색 화살표)와 루멘 직경 (빨간색 화살표)의 경우, 왼쪽의 이미지에 파란색 상자로 정의.
그림 3. 8 주 동안 고지방식이로 공급 생쥐의 내피 세포 기능 부전은 대동맥 고리에 분명 아니었다. 내피 세포 기능은 페닐에있는 아세틸 콜린 (10 -9 10 -5 M) (10 -5 M) 사전에 의해 유도 된 혈관 이완 반응에 의해 측정 하였다 대동맥 반지를 계약. 표준 다이어트, 야생 형 생쥐 표준 식단 (n은 = 8)을 공급, 높은 지방 다이어트, 야생 형 생쥐 4-6주 (N = 13)에 대한 높은 지방 음식을 먹이.
그림 4. 페닐-proconstricted 2 차 주문 m에서 아세틸 콜린의 용량 반응 곡선의 대표적인 원래 트레이싱WTB6 (A)와 sGCα 1 -/-S6 마우스 (B). 화살표에서 분리 esenteric 동맥 acetycholine 증가 용량 (10 -9 10 -5 M)의 누적 추가를 나타냅니다. X 축은 시간 (초)을 나타냅니다, Y 축은 루멘 직경 (μM)에 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. sGCα 1 균주 별 고혈압 - / - 마우스는 sGCα 1 혈관 반응성이 큰 손상 -/-S6 마우스 sGCα 1 -/-B6 마우스보다와 연관된 아세틸 콜린의 능력 (10 -9 ~ 10 -5. ) 유도 이완 페닐-P의 정량됩니다/ - - (열린 symbnols, 점선) B6에 쥐 (원) 또는 S6 (사각형) 유전 적 배경 남성 야생 유형 (WT, 폐쇄 기호, 전체 라인) 및 sGCα 1 recontracted (10 -5 M) 장간막 동맥 . Acetycholine에 의한 혈관 이완 sGCα 1 -/-B6 마우스에 비해 sGCα 1 -/-S6의 큰 범위에 장애가된다. N = sGCα 1 3,5,3 및 6 -/-S6, 각각 sGCα 1 -/-B6, WTS6. † * P <0.05 대 대 sGCα 1 sGCα 1 -/-B6, P <0.05 - / - 동일한 유전 적 배경. 적응 형 매입, 외. (2012).
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Discussion
마우스는 부분 때문에함으로써 인간의 병태 생리에 대한 마우스 모델을 생성하는 유전자 변형을 소개 할 수있는 가능성, 많은 연구자에 대한 선택의 실험적인 모델입니다. 혈관 활성 작은 저항의 상태가 아니라 더 큰 도관 혈관은 주로 혈관 시스템 (11)을 통해 혈액의 흐름의 조절을 정의합니다. 같은 쥐 같은 작은 동물에 저항 동맥의 크기는 미세 혈관 기능을 연구하는 와이어 myograph의 사용을 방지합니다. 압력 myographs는이 한계를 극복뿐만 아니라 근처에 생리적 조건 하에서 혈관 기능을 측정 할 수 없습니다.
우리는 이전에 sGCα 1 결핍 생쥐 수컷 때 129S6 (S6) 배경 (sGCα 1 -/-S6 5)에 고혈압하지만하지 않는 경우 C57BL / 6 (B6) 배경 (sGCα 1 -/-B6)에보고 4. 우리는 가설이이들/ - - B6와 S6 배경에 마우스 혈압 훈련 관련 차이는 sGCα 1 사이의 혈관 반응성의 차이 때문입니다. 압력 myograph를 사용하여, 우리는 3 차 주문 장간막 동맥의 내피 세포 의존적 혈관 이완 반응을 공부했다. 아세틸 콜린은 세포 내 칼슘 2 + 농도 증가를 통해 내피 세포의 nitric oxide synthase (eNOS)를 활성화 내피 세포의 수용체에 결합하는 무스 카린 수용체 작용제이다. 아니오 이후 휴식을 유도하는 기본 평활근 세포 층에 SGC 활성화 할 수 없습니다.
/ - - WT와 sGCα 1에서 분리 vasorelax 장간막 동맥 NO 파생 내피 세포의 기능을 비교하기 위해 압력 myography를 사용하여 / - - B6와 S6에 마우스 S6와 B6 배경에 마우스를, 우리는 sGCα 1 사이의 혈관 반응성의 차이를 확인 배경 10. sGCα 1 -결핍은 S6와 B6 생쥐 모두에서 손상된 내피 세포 의존적 혈관 이완과 관련되었다. 그러나,이 손상은 sGCα 1 -/-B6 마우스에 비해 sGCα 1 -/-S6에서 더 컸다. S6 생쥐에서 혈관 이완을 유도하는 아세틸 콜린의 감소 능력은 가능성이 있지만 sGCα 1 -/-B6 생쥐에서 sGCα 1 -/-S6 마우스에서 관찰 된 혈압의 증가에 기여하고있다. 높은 혈압은 종종 신장 이상 12 기인하지만, 이러한 결과는 장애 NO-cGMP의 신호 10,13과 관련된 예를 들어 혈관 평활근의 기본 이상은 직접 전신 고혈압의 발전에 기여할 수있는 새로운 가설을 강화 14.
결론적으로, 압력 myograph 기술은 혈관 생리학 또는 약학의 손에 매우 강력한 도구입니다 수 있습니다 BE는 마이크로 혈관 기능을 분석하는 데 사용됩니다. 우리의 연구는 전신 고혈압 모델에서 기본 혈관 이상을 감지하는 압력 myography의 적용을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 Drs를 인정하고 싶습니다. DMT 압력 myograph 및 박사 부부의 용 폴 황과 드미트리 Atochin. 높은 지방 다이어트 또는 표준 식단에 공급 쥐를 제공 Binglan 유와 종 레이.
자금 출처
이 작품은 하버드 의과 대학 (ES로 매입)에서 의학 학자 과학자 개발 미국 심장 협회 (ES로 매입)에서 부여 10SDG2610313, 그리고 엘레 및 마일 쇼어 50 주년 기념 친목 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P3786 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP121 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Phenylephrine | Acros Organics | AC20724 | |
| Acetylcholine | Sigma | A6625 | |
| Pressure Myograph System | DMT |
References
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