El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.
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Artículo de método
Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Interrogatorio escala del genoma de la función génica mediante RNA de interferencia (RNAi) es muy prometedora para la rápida identificación de las vulnerabilidades de células de cáncer químicamente manejables. Limitar el potencial de esta tecnología es la incapacidad para delinear rápidamente la base mecánica de los resultados fenotípicos y por lo tanto informar sobre el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidos molecularmente. Resumimos aquí los métodos de deconstruir fenotipos celulares inducidos por genes RNAi mediada por la orientación utilizando sistemas indicadores multiplexados que permiten el seguimiento del cáncer de los procesos clave asociados a células. Esta metodología de cribado de alto contenido es versátil y se puede adaptar fácilmente para la detección de otros tipos de bibliotecas moleculares grandes.
Introducción
Una variedad de los reporteros de luciferasa basados para el seguimiento de una gran variedad de procesos biológicos celulares están disponibles comercialmente. La mayoría de estas construcciones de ADN que codifican proteínas de luciferasa que son inducidas a expresar por estímulos o perturbaciones celulares específicos. Los reporteros transcripcionalmente basados en la mayoría de los sólidos colocan la expresión de una enzima luciferasa bajo el control de elementos potenciadores sintéticos o regiones promotoras de genes bien establecidos para su fiabilidad en informar de un evento de 1,2 transcripcional fisiológicamente relevante. También hay sistema....
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Protocolo
Protocolo completo tarda aproximadamente 4 días.
1. Preparación de las células para la transfección siRNA y Reportero
Vamos a introducir aquí un protocolo para interrogar bibliotecas siRNA utilizando un pequeño conjunto de siRNAs (384 diferentes siRNA piscinas matriz en formato de 96 pocillos con cada grupo que consiste en 4x siRNAs dirigidos a un solo gen) de un genoma de gran biblioteca de siRNA con fines ilustrativos. Para este estudio en particular, vamos a explotar las células HCT116 que exhiben señalización Wnt y Kras desviadas, y la actividad de p53. La línea celular apropiada en estudios destinados a int....
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Resultados
A pesar de los avances en la cartografía del paisaje mutacional de varios tipos de cáncer que utilizan enormes esfuerzos de secuenciación del genoma 12-14, seguimos sin contar con un enfoque sistemático para la traducción de las observaciones en las estrategias de intervención. En el cáncer colorrectal (CRC), las mutaciones que se prevé que afectará a los componentes de los tres procesos celulares - Wnt / β-catenina, p53, Kras y señalización - se encuentran en el 99% de todos los tumores que sugieren que son .......
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Discusión
Hay varios proveedores de sistemas de reportero luciferasa basados (tales como Promega, sistemas de focalización, New England Biolabs, y Thermo Fisher) que proporcionan útiles recursos en línea para aquellos que entretener una pantalla de alto rendimiento para la primera vez. Además, un número de excelentes críticas con respecto a la optimización de la utilización de pantallas de alto rendimiento para el descubrimiento de genes y cómo RNAi basada en los resultados de detección pueden estar integrados con otros conjunt.......
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Divulgaciones
Aceptar y LL son autores de una patente pendiente en relación con la tecnología de multiplexado luciferasa.
Agradecimientos
Reconocemos el apoyo financiero de CPRIT (RP100119) y la Fundación Welch (I-1665).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | ||
| Sistema de Luciferasa de Perfil de Vía 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | ||
| Reactivo de transfección Effectene | Qiagen Inc. | ||
| Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferasa Reactivo | de ensayo Sistemas de orientación | VLAR-1 | |
| HCT116 células | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Ensayo de citotoxicidad | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Modelo 832 | |
| Biomek FXP Estación de trabajo de automatización de laboratorio | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-lector de microplacas HTS multimodo | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Hemacitómetros Reichert de línea brillante | Hausser Scientific Company | 1490 |
Referencias
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent repor....
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