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5/6th nefrectomía en combinación con dieta alta en sal y el óxido nítrico sintasa inhibición para inducir la enfermedad renal crónica en la rata Lewis

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DOI:

10.3791/50398

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3 de julio de 2013

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

En este artículo

Resumen

Un método de dos etapas para establecer la enfermedad renal crónica (ERC) en ratas Lewis mediante la extirpación quirúrgica 5/6th de masa renal se describe. Combinación de la intervención quirúrgica, NOS-inhibición y una dieta alta en sal conduce a un modelo parecido a ERC humana, permitiendo el estudio de los mecanismos causales y el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

Resumen

La enfermedad renal crónica (ERC) es un problema global. Retardar la progresión de la ERC es una prioridad de la salud. Desde ERC se caracteriza por alteraciones de la homeostasis de complejos, modelos animales de integración son necesarias para estudiar el desarrollo y la progresión de la ERC. Para estudiar el desarrollo de las intervenciones terapéuticas con ERC y novedoso en la ERC, se utiliza el modelo de ablación nefrectomía 5/6th, un modelo experimental bien conocido de la enfermedad renal progresiva, se asemeja a varios aspectos de la enfermedad renal crónica humana. La reducción bruta de masa renal causa glomerular progresiva y lesiones túbulo-intersticial, la pérdida de nefronas remanentes y el desarrollo de la hipertensión arterial sistémica y glomerular. También se asocia con la pérdida progresiva intrarrenal capilar, la inflamación y la glomeruloesclerosis. Factores de riesgo de ERC invariablemente impacto en la función endotelial. Para imitar este, combinamos eliminación de 5/6th de masa renal con óxido nítrico (NO) y el agotamiento de una dieta alta en sal. Después de la llegada y aclimatación, los animales vuelvenceive un inhibidor de la NO sintasa (NG-nitro-L-arginina) (L-NNA), complementado con el agua potable (20 mg / L) durante un período de 4 semanas, seguido de uninefrectomía lados derecho. Una semana más tarde, una nefrectomía subtotal (SNX) se lleva a cabo en el lado izquierdo. Después SNX, los animales se les permitió recuperar durante dos días seguidos de LNNA en el agua potable (20 mg / L) para un período de 4 semanas. Una dieta alta en sal (6%), complementada en suelo chino (ver línea de tiempo Figura 1), se continúa durante todo el experimento. La progresión de la insuficiencia renal es seguida en el tiempo por la medición de urea en el plasma, la presión arterial sistólica y la proteinuria. A las seis semanas después de SNX, insuficiencia renal ha desarrollado. La función renal se mide con inulina 'estándar de oro' y el ácido para-amino hipúrico (PAH), la tecnología de liquidación. Este modelo de ERC se caracteriza por una reducción en la tasa de filtración glomerular (TFG) y el flujo plasmático renal efectivo (FPRE), hipertensión (presión arterial sistólica> 150 mmHg), proteinuria (> 50 mg/24 h) Y la uremia leve (> 10 mM). Características histológicas incluyen daño túbulo-intersticial reflejada por la inflamación, atrofia tubular y fibrosis y glomeruloesclerosis focal que conduce a la reducción masiva de glomérulos sanos dentro de la población remanente (<10%). Seguimiento hasta 12 semanas después de SNX muestra la progresión de la ERC.

Introducción

Debido a su naturaleza progresiva, extremo posterior enfermedad renal en estado terminal, y la morbilidad cardiovascular y mortalidad asociadas, la ERC es un problema creciente de salud pública 1. Retardar la progresión de la ERC por lo tanto, es una prioridad de la salud. Desde ERC se caracteriza por alteraciones de la homeostasis de complejos, modelos animales de integración son necesarias para estudiar el desarrollo y la progresión de la ERC. El riñón se compone de una amplia gama de diferentes tipos de células que interactúan entre sí. Esta complejidad no puede ser imitado in vitro.

Para el estudio de nuevas intervenciones terapéuticas en la ERC, se utiliza el modelo de 5/6th nefrectomía ablación, un modelo experimental bien conocido de la enfermedad renal progresiva, se asemeja a varios aspectos de la enfermedad renal crónica humana 2,3. La reducción bruta de masa renal causa glomerular progresiva y lesiones túbulo-intersticial, la pérdida de nefronas remanentes y el desarrollo de la hipertensión arterial sistémica y glomerular. Se asocia con progressive pérdida capilar intrarrenal 4, la inflamación y la glomeruloesclerosis. Factores de riesgo de ERC invariablemente impacto sobre la función endotelial 5. Se utilizó una cepa de rata (Lewis) que es relativamente resistente al desarrollo de la ERC y por lo tanto se combinaron eliminación de 5/6th de masa renal con óxido nítrico (NO) el agotamiento de 6, 7, 8 y una dieta alta en sal 9. Después de la llegada y aclimatación, los animales reciben un inhibidor de la NO sintasa (L-NNA), complementado con el agua potable (20 mg / L) durante un período de 4 semanas, seguido de uninefrectomía lados derecho (UNX) con la continuación de la L-NNA después de dos días . Una semana más tarde, la nefrectomía subtotal (SNX) es decir, eliminación de 2/3rds de masa renal se lleva a cabo en el lado izquierdo. Después de SNX, los animales se les permitió recuperarse durante 2 días, seguido de nuevo por 20 mg / L de LNNA en el agua potable durante un periodo de 4 semanas. Una dieta alta en sal (6%), complementada en suelo chino (ver línea de tiempo Figura 1), se continúa durante todo el experimento. Tque la razón para realizar la UNX en el lado derecho y el SNX en el lado izquierdo es que los vasos renales son más largas en el lado izquierdo que hace que sea más fácil acceder a los riñones sin estirar demasiado los vasos cuando el riñón está expuesta fuera del cuerpo . En la literatura, se describen modelos en los que los polos del riñón izquierdo se eliminan primero, seguido por UNX del riñón derecho y una semana más tarde 10,11,12. En nuestras manos este modelo mostró un desarrollo mucho más rápido de insuficiencia renal, pero también una variación mucho mayor en la pérdida de la función renal. La progresión de la insuficiencia renal es seguida en el tiempo por la medición de urea en el plasma, la presión arterial sistólica y la proteinuria. A las seis semanas después de SNX, insuficiencia renal ha desarrollado, que se caracteriza por una marcada reducción en la tasa de filtración glomerular (69%) y el flujo plasmático renal eficaz (62%) 13 de la hipertensión (presión sanguínea sistólica> 150 mmHg), proteinuria (> 50 mg/24 hr) y la uremia leve (> 10 mM). Características histológicas incluyen Tubuldaño o-reflejado por la inflamación intersticial, atrofia tubular y fibrosis y glomeruloesclerosis focal que conduce a la reducción masiva de glomérulos sanos dentro de la población remanente (<10%). Seguimiento hasta 12 semanas después de SNX muestra la progresión de la ERC, proporcionando una ventana de oportunidad para la evaluación de las intervenciones terapéuticas.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizan con arreglo a los animales de experimentación pautas éticas del comité animal experimental Utrecht. El protocolo se lleva a cabo bajo la dirección y aprobación del cuidado de los animales de la institución del autor y el empleo.

ERC se induce en ratas Lewis macho endogámicas (Charles River, Sulzfeld, Alemania) a la edad de 8 semanas. Las ratas están alojados en condiciones normales en un ambiente de luz, temperatura y humedad controladas.

1. Preparación para la Cirugía

  1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos:
    • 1 tejido estudiante fórceps 1-2 dientes de 12 cm
    • 1 estudiante forceps patrón estándar
    • 2 pinzas Semken
    • 1 Mayo tijeras
    • 1 estudiante iris tijeras
    • 1-Olsen Hegar portaagujas con tijeras
    • Manta
  2. Lista de control de inventarios:
    • Mesa de operaciones con el cojín de calentamiento y la lámpara
    • O 2, isoflurano
    • Tejidos
    • Maquinilla de afeitar
    • Balanza
    • Set operativo estéril
    • 5x5 gasa estéril y 10x10
    • 70% de alcohol
    • Solución de NaCl al 0,9%
    • 1 ml jeringa
    • Needles (25G)
    • Juntas de gel de espuma: Spongostan
    • Vicryl 4.0 y 5.0
    • La buprenorfina 0,03 mg / kg (diluido 1:10 en salina fisiológica)
    • Jaula limpia para ratas después de la cirugía

2. Derecho uninefrectomía Side

  1. Desinfectar la tabla con un 70% de alcohol.
  2. Lugar de rata en la caja de la inducción y de inducir la anestesia con isoflurano y 4% 1 litro de flujo de O 2. Nota: dependiendo de la cepa de ratas utilizada, pre y perioperatoria analgesia se prescriben, esto tiene que ser discutido con el veterinario local.
  3. Transferencia de rata a la mesa y el lugar nariz en cono. La rata y el cono de nariz se colocan en una almohadilla caliente para mantener la temperatura corporal de la rata. La rata is ventilado con una mezcla de 2% de isoflurano y 1 litro de O 2.
  4. Shave el flanco de la rata y desinfectar con alcohol. Lavar y desinfectar las manos y utilizar guantes quirúrgicos estériles. Use un gorro de la cabeza y una máscara. Hacer un 1-1,5 cm incisión paralela a las costillas con pinzas anatómicas y tijeras romas. Exponga el riñón mediante disección roma de los músculos de la espalda.
  5. El polo inferior del riñón es visible, use cuidadosamente las pequeñas pinzas romas para sujetar el tejido adiposo perirrenal. Externalizar el riñón tirando suavemente de la grasa perirrenal con fórceps. Tenga cuidado de no molestar a la glándula adrenal durante este procedimiento. La glándula suprarrenal se puede quitar fácilmente mediante la colocación de una pinza en el sitio medial en el tejido graso y se movió suavemente hacia arriba entre la glándula suprarrenal y el riñón como se muestra en la Figura 2.
  6. Coloque riñón suavemente una gasa y clara de los alrededores grasa y tejido conectivo. Identificar la arteria y la vena renal y colocar una ligadura (5,0vicryl) con un solo nudo alrededor de los vasos, pero no atar el nudo.
  7. Mueva el nudo flojo cuidadosamente a lo largo de los vasos hacia la aorta por aproximadamente 0,5 cm, para crear un espacio entre el riñón y el nudo. Esto se hace para evitar que la ligadura se deslice fuera después del corte.
  8. Haga un nudo con dos nudos dobles. Si se detiene la perfusión, el color del riñón cambiará inmediatamente a marrón. No corte los extremos de la ligadura.
  9. Cortar los vasos renales cerca de los riñones y extraer el riñón. Tire suavemente los largos extremos de la ligadura para comprobar el sangrado de los vasos renales. La ligadura debe permanecer en el lugar en el buque. Cortar los largos extremos de la ligadura. Nota, los vasos renales remanente se retraen en la cavidad abdominal inmediatamente.
  10. Seque riñón extirpado secar y pesar que.
  11. Cierre la incisión del músculo esquelético con el funcionamiento de las suturas con Vicryl 5.0. Inyectar 0,10 ml (0,03 mg / kg) im buprenorfina en la extremidad posterior. Cierre lapiel con Vicryl 4.0 con suturas intracutáneas. Esto evita que las ratas de la apertura de la herida. Nota: debido a la depresión respiratoria en ratas Lewis, sólo damos analgesia postoperatoria justo antes de apagar el isoflurano.
  12. La casa de los rata en una jaula solitaria limpio y con fácil acceso a los alimentos y el agua. Coloque la mitad de la jaula sobre el calentamiento pad O / N y comprobar cuidadosamente la rata al día siguiente. Cuando la herida se cierra y la rata es activa, la cual es normalmente entre 6 y 12 horas después de la cirugía, la rata se puede colocar de nuevo en el alojamiento en grupo.

3. Lado izquierdo Nefrectomía Subtotal

  1. Siete días más tarde, las mismas preparaciones se realizan en el lado izquierdo como para el lado derecho como se describe 2,1-2,5. Antes de la cirugía, se calcula la cantidad de tejido renal que necesita ser eliminado debido a que corresponde a aproximadamente 2/3rds de el peso del riñón derecho. Preparar pequeñas piezas de espuma de gel (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) antes de la cirugía.
  2. Coloque unas tijeras afiladas alrededor del polo superior del riñón izquierdo y resección del polo superior de un solo golpe (para la ubicación de tijera, ver Figura 3). Cubra inmediatamente con un trozo de espuma de gel y ejercer una presión suave con una gasa estéril.
  3. Repita con el polo inferior del riñón como en 3.3.
  4. Levante riñón para evitar la coagulación de la piel. Mantenga una presión leve en ambos almohadillas de espuma de gel con una gasa estéril hasta que el sangrado se detenga. Cuando la hemorragia persiste, añada otra almohadilla de espuma.
  5. Coloque remanente renal con gel adherente almohadillas de espuma en el interior del abdomen. Cierre el músculo y la piel y siga 02.09 a 02.12.

4. Sham Cirugía

  1. Controles de operación simulada se someten al mismo procedimiento con el fin de exponer a los riñones. En lugar de extirpar el riñón o el corte de los polos una semana más tarde, ambos riñones están decapsulated en un intervalo de una semana, teniendo cuidado de no molestar a las glándulas suprarrenales. Cierre de la herida y los cuidados postoperatorios son Identificaciónentical a 2,11 y 2,12.

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Resultados

Después de la nefrectomía subtotal, aproximadamente 1/6o de la masa total renal se deja. Figura 4 muestra el peso de la pieza extraída del riñón derecho con media y desviación estándar de dos experimentos anteriores. Se debe tener en cuenta que en la semana después de UNX, hipertrofia del riñón izquierdo se produce, lo que indica que el peso que debe ser eliminado calcula en función del peso del riñón derecho siempre se traduce en menos de extracción 5/6th. Sin embargo, ya que no es posible determinar e...

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Discusión

La extirpación quirúrgica de 5/6th de masa renal en la rata Lewis, combinada con una dieta alta en sal y la inhibición de la NOS temporal conduce a un modelo de enfermedad renal crónica que se asemeja a ERC humana y permite el estudio de los mecanismos causales y la eficacia de las intervenciones terapéuticas en enfermedad renal crónica.

El modelo de nefrectomía 5/6th es un modelo bien conocido y ampliamente descrito para el CKD. Sin embargo, la simple eliminación de 5/6th de masa renal no c...

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Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Damos las gracias a Krista den Ouden por su excelente asistencia técnica. Esta técnica ha sido financiado por la fundación holandesa de riñón, donación C06.2174. MCV es apoyada por la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) Vidi-grant 016.096.359.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
   reactivo
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan dental: almohadillas de espuma de gel 1x1x1 cmJohnson& JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
Buprenorfina (0,3 mg/ml)A través de un farmacéutico local ordenado por Reckitt Benckiser pharmaceuticalsdesconocido 
   Equipo
Pinza de Tejido para Estudiantes - 1x2 Dientes 12 cmFine Science Tools (FST)91121-12 
Pinzas de patrón estándar para estudiantesFST91100-12 
Tijeras de mayoFST14010-15 
2X Pinza Semken FST11008-13 
Tijeras de iris para estudiantesFST91460-11 
Portaagujas Olsen-HegarFST12002-14 

Referencias

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