Artículo de método

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

DOI:

10.3791/50433

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20 de mayo de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

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Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un flujo de trabajo para analizar los perfiles metabólicos en muestras biológicas de interés, incluyendo: células, suero o tejido. La muestra se separa primero en fracciones polares y no polares por una extracción en fase líquido-líquido, y se purificó parcialmente para facilitar el análisis aguas abajo. Ambas fases acuosas (metabolitos polares) y metabolitos orgánicos (no polares) de la extracción inicial se procesan para medir un amplio rango de metabolitos. Los metabolitos se separaron mediante diferentes métodos de cromatografía de líquidos en base a sus propiedades de la partición. En este método, presentamos microflow ultra-desempeño (UP) los métodos de LC, pero el protocolo es escalable a los flujos más elevados y presiones más bajas. La introducción en el espectrómetro de masas puede ser a través de cualquiera de las condiciones generales de origen optimizadas o compuesto. La detección de una amplia gama de iones se lleva a cabo en el modo de barrido completo tanto en modo positivo y negativo en un amplio rango de m / z usando alta resolución en una recientemente calibrated instrumento. Etiqueta libre de análisis diferencial se lleva a cabo en las plataformas bioinformáticas. Las aplicaciones de este enfoque incluyen la detección vía metabólica, el descubrimiento de biomarcadores y el desarrollo de fármacos.

Introducción

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Debido a los recientes avances tecnológicos en el campo de HRMS, no focalizados, generador de hipótesis metabolómica enfoques se han convertido en un enfoque viable para el análisis de muestras complejas. 1 espectrómetros de masas capaces de facilitar la resolución 100000 de rutina bajo parte por millón (ppm) de masa de precisión han sido ampliamente disponible de varios proveedores. 2,3 Esta masa de precisión permite una mayor especificidad y la confianza en una asignación preliminar de la identidad del analito, reconocimiento de patrones isotópicos, y la identificación aducto. 4 Cuando se combina con un procedimiento de extracción adecuado y de alto rendimiento LC o UPLC, mezclas complejas puede ser analizado con especificidad adicional derivada de los datos de tiempo de retención. 5 UPLC posee una mayor eficiencia cromatográfica y permite tiempo mayor sensibilidad, resolución y análisis que expresa una mayor cobertura de la metaboloma posible. 6 Los grandes conjuntos de datos resultantes se pueden integrar en cualquierde software de análisis diferencial múltiple y extraídos de los patrones de útiles individuales o analitos de interés. 7,8,9,10,11 impacta putativos se pueden identificar inicialmente utilizando una combinación de algoritmos de detección de picos, basada en la predicción exacta fórmula química masa, la predicción de la fragmentación, y químico búsqueda de base de datos. Este enfoque permite la priorización de los objetivos de tiempo de identificación estructural completo o para el desarrollo de la dilución del isótopo estable más sensible y más específica UPLC / seleccionado o múltiples reacción monitoreo / estudios de MS, que son los actuales métodos estándar de oro para la cuantificación. 12

La naturaleza variable de las muestras biológicas ha conducido a la optimización de protocolos de extracción de orina 13, 14 células, suero de 15, 16 o tejido. Este protocolo de extracción de características para las células, el suero, y el tejido. En su caso, las observaciones y referencias adicionales se han incluido modificacionesción del procedimiento para abordar la inclusión de los isótopos estables, o la inclusión de metabolitos especialmente inestables.

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Protocolo

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1. Extracción de muestras a partir de células

  1. Para una placa de 10 cm de células: recolectar 1,5 ml de suspensión de células levantado en los medios de comunicación en un tubo de centrífuga de 10 ml de vidrio previamente etiquetado. Para las líneas de adherentes, las células deben ser levantadas con raspado suave en 1,5 ml de medio mantenido en hielo Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir una alícuota adecuada en este paso.
    Comentario: enfriamiento del metabolismo celular es crucial para ciertos metabolitos. Para el análisis de los metabolitos sensibles al tiempo, se deben considerar los procedimientos tales como extracción con metanol frío. 17
  2. Añadir 6 ml de cloroformo (CHCl3) / metanol (CH3OH) (02:01, v / v) a cada uno de los tubos de vidrio de 10 ml que contienen las muestras. Establecer las muestras en una coctelera o multi-vórtice a baja velocidad durante 30 min. Después de agitar, se centrifugan las muestras con un nivel bajo de aceleración / desaceleración en 1935 xg durante 10 min a 4 ° C para separar completamente las fases.
    Opcional : Para evitar el uso de CHCl3, se pueden realizar extracciones con diclorometano (CH 2 Cl 2) 18,12.
  3. El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transfiera la capa orgánica (inferior) a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Continúe 4.1.
  4. Transferir la fase acuosa superior más tarde en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Se evapora la muestra en atmósfera de gas nitrógeno. Continuar 2.6.2 para desalación fase acuosa o continuar hasta el 4,1 para el análisis directo.

2. Extracción de muestras de suero

  1. Transferir 20 l de suero en un tubo Eppendorf de 2 ml de plástico Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir una parte alícuota apropiada en este paso.
  2. Añadir 190 l de CH 3 OH y agitar durante 10 segundos.
  3. Añadir 380 l de CHCl3 y agitar durante 10 seg.
  4. Añadir 120 l de H 2 O para inducir la separación de fases. Vortex las muestras durante 10 segundos y permitir que se equilibre a temperatura ambiente durante 10min.
  5. Centrifugar las muestras a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C para separar las fases.
  6. Pasar la fase orgánica inferior en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Continúe 4.1.
  7. Transferir la fase acuosa superior más tarde en un plástico de 2 ml tubo Eppendorf limpio. Se evapora la muestra en atmósfera de gas nitrógeno.
  8. Vuelva a suspender la muestra en 200 l H 2 O. Reactivos de ácido o base (0.1% de ácido acético, ácido fórmico o hidróxido de amonio al 0,1%) pueden ser utilizados para extraer preferentemente metabolitos sensibles al pH. Someter a ultrasonidos durante 20 min en hielo para volver a suspender la muestra completamente.
  9. Active las columnas giratorias C18 con 500 l CH 3 OH.
  10. Equilibrar la columna de centrifugación con dos lavados de 500 l H 2 O y luego cargar la muestra. Si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en los pasos de lavado.
  11. Lavar con 500 l H 2 O para desalar la muestra. Una vez más, si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en el lavadopasos.
  12. Eluir con dos volúmenes de 200 l 80% CH3OH en H 2 O en un 2 ml tubo Eppendorf limpio previamente etiquetado. Una vez más, si se utilizan reactivos de ácido / base de mantener esta concentración en los pasos de lavado. Continúe 4.1.

3. Extracción de muestras de tejido

  1. Dependiendo del tejido, utilizar entre 10-100 mg de tejido congelado. Añadir toda la pieza de tejido a un 2 ml bajo tubo Eppendorf de retención de pre-marcado con 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) en un baño de hielo Opcional:. Si se utilizan las normas internas, añadir en la memoria intermedia, antes de añadir el tejido.
  2. Se homogeneiza el tejido en hielo con un triturador de tejidos eléctrico durante 30 segundos en cada Eppendorf. Entre las muestras, limpiar el triturador de tejidos en dos tubos separados que contienen CH 3 OH y H 2 O, respectivamente.
  3. Transferir el homogeneizado de tejido con una pipeta de plástico de 10 ml en un tubo de centrífuga de vidrio previamente etiquetado. Después de la transferencia, enjuague cada tubo Eppendorf2x con 1 ml de CH3OH y añadir los lavados a la homogeneizado de tejido en los tubos de vidrio.
  4. Añadir 4 ml de CHCl3 para cada uno de los tubos de vidrio de 10 ml que contienen el homogeneizado de tejido y CH 3 lavados OH. Establecer las muestras en una coctelera o multi-vórtice a baja velocidad durante 30 min.
  5. Después de agitar, centrifugar las muestras con un nivel bajo de aceleración / deceleración a 1935 xg durante 10 minutos para separar completamente las fases Opcional:. Para evitar el uso de cloroformo, extracciones se han desarrollado con CH 2 Cl 2.
  6. El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transfiera la capa orgánica (inferior) a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Continúe 4.1.
  7. El uso de un tallo largo pipeta Pasteur, transferir la fase acuosa a un nuevo pre-etiquetados 10 ml tubo de centrífuga de vidrio. Ir a la 2.6.2 de desalación o continuar 4.1.

4. Re-suspensión y filtración de las muestras para la UPLC

  1. Se evapora el samples bajo gas nitrógeno.
  2. Reconstituir secó abajo muestras en un volumen apropiado de la solución de partida para el método UPLC deseada (véase la Tabla 1). 50-100 l es por lo general un volumen de re-suspensión deseable. Vórtice suavemente y / o una pipeta la muestra hacia arriba y hacia abajo para ayudar a disolver los analitos.
  3. Transferir la muestra en un tubo de 0,22 micras filtro de nylon y giran a hasta 14.000 xg hasta que la muestra ha pasado completamente a través del filtro (~ 5 minutos). Asegúrese de que no hay precipitados visible que queda en la muestra.
  4. Transferir el sobrenadante de la muestra filtrada en un vial de UPLC de pre-marcado con inserto. Tapa del vial, a continuación, chasquear el vial para eliminar las burbujas de la parte inferior del vial de muestra. Colocar la muestra en el inyector automático refrigerado (4-5 ° C).

5. Configuración UPLC

  1. Utilizando el software de control para el cromatógrafo de líquidos, crear una carrera por la muestra orgánica con sede fuera de las condiciones enumeradas en Tabla 1. A continuación, crear un método para la fase acuosa fuera de las condiciones enumeradas en la Tabla 1 Opcional:. Si un conjunto conocido de los analitos de interés son de gran interés, optimizar las condiciones UPLC utilizando el pesado análogo marcado de estos compuestos, y generar un método que utiliza estas condiciones .
  2. Deje que la UPLC se equilibre adecuadamente. Esto debe incluir un cebado completo de disolventes antes de colocar una columna, y siguiendo las instrucciones del fabricante para el volumen de equilibrio de una nueva columna (generalmente 3-5 volúmenes de columna). Mantener un registro de iniciar de nuevo la presión para ayudar a diagnosticar problemas en el futuro.

6. Configuración espectrómetro de masas

  1. Usando el software de control para el espectrómetro de masas de alta resolución, crear un método de modo positivo usando las condiciones que se indican en la Tabla 2. Luego, utilizando las mismas condiciones, crear un método de modo negativo Opcional:. Si un conjunto conocido de los analitos de interés son de alta interest, fuente de optimizar y condiciones óptica utilizando la pesada etiqueta analógica de estos compuestos, y generar un método que utiliza estas condiciones.
  2. Limpiar y calibrar el instrumento, establecer un aerosol estable en el espectrómetro, y dar tiempo para la solución de calibración para disipar adecuadamente de la fuente y la óptica. Estabilidad aceptable de aerosol debe dar un 3-5% RSD de la intensidad sobre al menos 100 exploraciones con la inyección de solución de calibración a la misma velocidad de flujo como se utiliza el método de LC.
  3. Establecer la secuencia de todas las muestras, ajustar el volumen de inyección adecuada y ejecute un espacio en blanco antes de la primera muestra. Si se sospecha de remanentes o matriz efectos entre las muestras, ejecute blancos / lavaderos adecuados. Las muestras deben ser configurado de una manera al azar utilizando un generador de números aleatorios y una clave para evitar los efectos introducidos por lotes por el análisis.
    Comentario: las muestras de control de calidad, incluidas las normas de isótopos estables o estándares analíticos de posibles objetivos pueden serextremadamente valioso en la solución de problemas y asegurar resultados fiables y reproducibles y válidos. Una técnica de reproducir de una única muestra estándar seguido por un blanco de disolvente se puede utilizar para accesos de desviación de intensidad de la señal y tiempo de retención, así como el arrastre en el ensayo en blanco.
  4. Comienza la secuencia y seguimiento periódico de problemas, incluyendo las fluctuaciones de presión o pérdida de intensidad de la señal a través de la ejecución. Si se detectan problemas graves, detener la carrera, y repetir de 6.2.

7. Análisis diferencial

  1. Dos flujos de trabajo se presentan en este protocolo. La primera es a través del tamiz 2.0, el software de análisis diferencial libre de marca patentada vendido por Thermo Fisher. El segundo flujo de trabajo es a través de XCMS Online, una plataforma gratuita a través del Instituto de Investigación Scripps. 11 Antes de comenzar el análisis diferencial, comprobar manualmente las TICs o mirar cromatogramas filtrados para cualquier compuesto conocido en la muestra para asegurar la reproducibilidad de las carrerasy la inyección / estabilidad UPLC / aerosol a través de todas las muestras.
  2. CRIBA
    1. Transfiera los archivos de datos brutos. Desde el espectrómetro de masas en el disco duro de la estación de trabajo donde está instalado tamiz. (Nota: correr tamiz con los datos almacenados en una unidad conectada en red o el puerto USB no es recomendable, ya que puede limitar la velocidad de análisis.)
    2. Abrir TAMIZ, y comenzar un nuevo experimento.
    3. Cargue los archivos correspondientes en tamiz.
    4. Asignar los grupos de comparación y seleccionar un archivo de referencia único para permitir tamiz para generar los parámetros para el análisis.
    5. Siga las instrucciones y ajustar los parámetros según los requisitos de cualquier experimento individual. A menudo es aconsejable comenzar con parámetros estrictos, y luego ir hacia atrás y afloje los parámetros de configuración a medida que más generosos pueden alargar el tiempo de análisis.
    6. Cargue la lista aducto correcta para el modo positivo o negativo en los parámetros.
  3. XCMS Online
    1. Convertir archivosen un formato aceptable para XCMS línea. En nuestro caso, nos convertimos al formato mzXML. 19
    2. XCMS abiertas en línea, y crear empleo.
    3. Subir y nombrar los conjuntos de datos. Sólo dos conjuntos de datos (por ejemplo, control vs tratamiento) se pueden cargar como XCMS independientes se limita a comparaciones cara a cara.
    4. Seleccione los ajustes que desee de la lista desplegable. Parámetros pre-pobladas están disponibles para diferentes configuraciones de instrumentación, y estos pueden ser modificados aún más para las necesidades experimentales. En nuestro caso, utilizamos la configuración HPLC-Orbi2.
    5. Enviar y confirme trabajo.
  4. Análisis de Datos
    1. Para colador y XCMS una lista de marcos y características, respectivamente, se llenará una vez finalizado el análisis. Asegúrese de que la alineación LC superpone los picos emblemáticos. Si cualquiera de las carreras no alineados LC muestran gran desviación en los picos de señal esto puede indicar un problema con la muestra.
      Opcional: Para tamiz, si se utilizan las normas internas, busqueel grupo pico correspondiente y normalizar el marco seleccionado. Para XCMS On-line, la normalización puede realizarse en una hoja de cálculo después de la exportación.
    2. Representar gráficamente los datos por el coeficiente de variación (CV) dentro de una población de la muestra como (por ejemplo, muestras de control). Los grandes valores de CV pueden indicar un problema con uno o más de la muestra. Ordenar la lista en función de las características deseadas (por ejemplo, valor de p <0,05, doble cambio> 1,5, baja desviación estándar dentro de un grupo, etc.)
    3. Examine cada pico para una alineación apropiada pico entre los grupos, la integración de picos, pico gaussiano forma, intensidad de la señal, los isótopos y la asignación aducto.
    4. Exportar datos como se desee para su posterior análisis o para generar listas masivas dirigidas para confirmación y MS n experimentos.

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Resultados

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Los resultados presentados muestran los datos seleccionados de un tratamiento de 6 h de células de glioblastoma SH-SY5Y con el pesticida y complejo mitocondrial I rotenona inhibidor. Por razones de brevedad, se presenta sólo los datos en modo de fase positivos orgánicos. Las muestras se procesaron y se analizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 1, Tabla 1, Tabla 2) y se cargaron en dos plataformas de análisis diferencial de la etiqueta libre de cuantificación, colador y XCMS línea. Aunque un g...

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Discusión

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Untargeted metabolómica ofrece una poderosa herramienta para la investigación de biotransformaciones endógenas o xenobióticos, o la captura de un perfil metabólico de una muestra de interés. La salida de las escalas técnica con la resolución y la sensibilidad de la tecnología utilizada para separar y analizar la muestra, la capacidad para hacer frente a los grandes conjuntos de datos generados, y la capacidad de extraer el conjunto de datos para obtener información útil (por ejemplo, precisa la búsqueda de base...

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Divulgaciones

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Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Reconocemos el apoyo de subvenciones del NIH P30ES013508 y 5T32GM008076. También damos las gracias Thermo Scientific para acceder a SIEVE 2.0 y los Dres. Eugene Ciccimaro y Mark Sanders de Thermo Scientific útil para los debates.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo
Solución salina tamponada con fosfatoMediatech21-031-CM
Agua (H2O)Fisher ScientificW7-4(optima)
Acetonitrilo (CH3CN)Fisher ScientificA996-4(optima)
Metanol (CH3OH)Fisher ScientificA454-4(optima)
IsopropanolFisher ScientificA464-4(optima)
Cloroformo (CH3Cl)Sigma-Aldrich366927Hazard
Diclorometano (CH2Cl2)Acros Organics61030-1000Para reemplazar el cloroformo
Éter dietílicoSigma-Aldrich346136Para reemplazar el cloroformo
Ácido fórmico (FA)Fisher Scientific(optima)
NH4OHFisher ScientificA470-250(optima)
Formiato de amonio (HCOONH4)Sigma-Aldrich78314
MicroSpin C18 ColumnasNest Group IncSS18V
Pasteur PipetasFisher Scientific13-678-200
10 ml Tubos de centrífuga de vidrioKimble Chase73785-10
Tubos de centrífuga de plástico de 10 mlCellTreatCLS-4301-015
LC Viales (vidrio)Aguas60000751CV
Insertos LC (vidrio)AguasWAT094171
Viales LC (plástico)Aguas
0,22 μ m FiltrosCorning8169nylon
2 ml Tubos EppendorfBioExpressC-3229-1Baja Retención
Equipment
High Resolution EspectrómetroThermo ScientificLTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLCWatersnanoACQUITY UPLC
SourceMichromThermo Software de
Thermo ScientificSIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μ m tamaño de partícula, 150 mm x 100 μ m
Acentis Express C8Sigma-Aldrich542622.7 μ m tamaño de partícula, 15 cm x 200 μ m
186002640 análisis diferencial de fuente avanzada

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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