Summary
תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.
Abstract
תאי Neuroprogenitor (NPCs) מבודדים מהמוח העוברי האנושי הורחבו בתנאי שגשוג בנוכחות גורם אפידרמיס צמיחה (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) כדי לספק שפע של תאים. NPCs הובדלו בנוכחות שילוב חדש של גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורם במוח (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) וחומצה רטינואית על מנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר כדי להשיג נוירון עשירה בתרבויות. NPCs גם הובדלו בהעדר neurotrophins, DBC וחומצה רטינואית ובנוכחותו של גורם נוירוטרופי הריסים (CNTF) להניב תרבויות astrocyte עשיר. NPCs המובחן התאפיינו מכתים immunofluorescence לפנל של סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43. חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) וSTAT3, סמני astrocyte, התגלו ב10-15% מNPCs המובחן. כדי להקל עלאפיון מולקולרי תאים מסוג מסוים, microdissection ללכוד לייזר בוצע לבודד את תאי עצב בתרבית על naphthalate פוליאתילן שקופיות קרום (PEN). השיטות שתוארו במחקר זה מספקים כלים רבי ערך כדי לקדם את ההבנה של המנגנון המולקולרי של ניוון מוחיים שלנו.
Introduction
נוירוגנזה חיים ארוכים ידועה להתרחש באזור subventricular של החדרים לרוחב ובשכבת subgranular של gyrus משוננת של המוח של היונקים הבוגרים 1. תאי Neuroprogenitor (NPCs) שמקורם באזורים אלה הם תאי multipotent שיכול להתמיין לתאי עצב, האסטרוציטים וoligodendrocytes 2. NPCs יצרו עניין בשל הפוטנציאל שלהם להיות מושתלים בחולים עם הפרעות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) 3. מחקרים עם NPCs יש בדרך כלל מתמקדים בזווית ההשתלה הזה, אבל את הפוטנציאל של תאי עצב שמקורם בNPC כמודל תרבית תאים כדי לקבוע את המנגנון של ניוון מוחיים לא נוצל במלואו. מחקרים קודמים המשמשים בדרך כלל נוירונים לאחר mitotic בודדו מרקמות המוח מכרסם אשר צריכים להיות מבודדים עבור כל ניסוי כפי שהם לאחידוש עצמי. למרות שניתן להרחיב שורות תאי נוירובלסטומה האדם כולל SH-SY5Y ותאי SK-N-MC, אין להם את המאפיינים של נוירונים עיקרי. NPCs אדם, לעומת זאת, מציע גם יתרונות כי הם יכולים להיות מורחבים למעברים מרובים ויכולים להיות מובחן כדי לייצר אוכלוסיית תא עם המאפיינים של נוירונים העיקרי 4,5. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול בידול חדש כדי להשיג אוכלוסיית נוירון עשיר עקבית מNPCs זמין מסחרי מבודד מהמוח העוברי אנושי. מכיוון שתרבויות אלה מכילות אחוז קטן של תאי גליה, אנחנו צריכים שיטות נוספות כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של תאי עצב לאפיון מולקולרי. microdissection ללכוד לייזר (LCM) הוא טכניקה חדשנית שבו אוכלוסייה הומוגנית של תאים מקטע רקמה יכולה להיות שנתפסו באופן סלקטיבי לניתוח ביטוי גנים 6. המוח הוא רקמה הטרוגנית המורכבת של נוירונים, גליה וטאי הסלולרי האחרPES. LCM נעשה שימוש כדי לקבוע ביטוי נוירון הספציפי גן מנתח 7-10. אנחנו ביצענו בעבר LCM של נוירונים בהיפוקמפוס מחלקים לספירה (Tg2576) מוח עכבר כדי להראות ביטוי ירידה של חלבון מחייב אלמנט תגובת AMP המחזורי (CREB) וBDNF במיוחד בנוירונים בהיפוקמפוס 11. במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליכים להרחבת NPCs אדם, בידול עצבי, מכתים immunofluorescent עבור סמנים עצביים ו LCM עבור הבידוד של נוירונים בתרבית בשקופיות קרום PEN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרחבת NPCs האדם (איור 1)
- להחיות את המניה הקפואה של NPCs אדם מהמוח העוברי (Lonza, Walkersville, MD, ארצות הברית) ותרבותם בהשעיה בT-75 צלוחיות כneurospheres (איור 1 א) במדיום neurobasal המכילה תוספי התפשטות, EGF (10 ng / ml) ו FGF (10 ng / ml).
- אחרי 3 ימים בתרבות, להעביר את neurospheres לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 500 סל"ד במשך 5 דקות.
- בטל supernatant והותיר אחריו ~ 100 בינוני μl מעל התא גלולה ולהעביר לתוך צינור Eppendorf. גלולה 100 תא μl מספיק להתפצל ל2 T-75 צלוחיות. אם פחות, לצמצם את מספר צלוחיות כתאי neuroprogenitor מצליחים להתרבות אם לפצל דק.
- Triturate את הכדור עם קצה μl 200 50x, תוך שמירה על קצה 200 μl נגד החלק התחתון של הצינור. מחלקים את ההשעיה התא באופן שווה לשני חלקים ולהוסיף אותם ל2 T-75 צלוחיות (1-2 מפוצל), אחת להמשיךהתרחבות ונוספת לבידול.
- המשך התרבות של תאי neuroprogenitor להרחבה (בקבוק הראשון) על ידי שינוי הבינוני כל 4-5 ימים עד neurospheres להגיע לגודלם המקורי של 300-500 מיקרומטר. השנה בינונית על ידי צנטריפוגה (סל"ד 500; 5 דקות), לבטל את המדיום הישן ולהוסיף מדיום חדש.
2. בידול של NPCs האדם לתרבות Neuron עשירה (איור 2)
- להתמיינות של תאי neuroprogenitor לתרבות עשירה של תאי עצב, במקום coverslip יחיד לבאר כל צלחת 24 גם ומעיל עם 100 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי-L-ליזין על ידי הוספת 500 μl לכל אחד. דגירה את הכלים ל30 דקות ב RT.
- לשאוב-L-ליזין פולי הפתרון ולשטוף את הצלחת עם מים סטריליים.
- בשלב בא, מעיל הבארות של הצלחת עם 500 μl 5 laminin עכבר מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את הבארות עם PBS.
- 4 ימים לאחר splitting התאים (שלב 1.4), להעביר את neurospheres הקטנה בבקבוק שכותרתו 'לבידול' לכלים מצופים בצפיפות של ~ 500 neurospheres לכל טוב של צלחת 24 גם.
- לאחר 6 שעות, כאשר neurospheres לצרף הצלחת, להסיר את מדיום ההתפשטות ולהוסיף בינוני בידול בהיקף של מדיום neurobasal, תוסף B27, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 מ"מ), וחומצה רטינואית (2 מיקרומטר).
3. הכתמה Immunofluorescence של NPCs הבדיל (איור 3)
- בעקבות התרבות של תאי neuroprogenitor במדיום בידול עצבי במשך שבועיים, תרבות נוירון עשיר מתקבלת. יש לשטוף את תאי העצב פעם אחת ב PBS ולאחר מכן לתקן אותם בparaformaldehyde 4% במשך 30 דקות. ברגע שנקבע, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
- דגירה התאים עם חיץ permeabilization (BSA 5% ו0.2% טריטון X-100 PBS) ב RT עבור 60 דקות.
- דגירה הצלחות O / N ב 4 i C °שייקר na עם השילוב הבא של polyclonal ונוגדנים חד שבטיים בBSA 3% ב-PBS: NeuN (1:250) וsynapsin (1:250); אצטיל כולינסטרז (1:500) וsynaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) וGAP43 (1:250); STAT3 (1:500) וGFAP (1:1,000).
- שטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה אותם עם נגד ארנב-Cy3 ונוגדנים משני אנטי עכבר FITC ב RT בחושך במשך 90 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS.
- הנח 10 μl של מדיום הרכבה על גבי זכוכית, להוציא את coverslip ממנת התרבות עם מלקחיים, ולמקם אותו במהופך על ההרכבה בינונית. בעדינות, לנגב כל מדיום הרכבה עודף וסוגר את הקצוות עם לק.
- לבחון את הנוירונים immunostained במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. Microdissection לכידת לייזר של נוירונים (איור 4)
- להבדיל NPCs לתרבות נוירון עשיר בשקופית קרום PENs מצופה laminin פולי-L-ליזין והעכבר בעקבות ההליכים המתוארים באיור 2.
- לבצע את כל השלבים הבאים בתנאי RNase חינם.
- כתם התרבויות באמצעות HistoGene כתם (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים.
- מצא האזורים של אוכלוסיות נוירונים טהורות נטולות האסטרוציטים באמצעות תמונת מפת הדרכים של כל השקופית עם מערכת Veritas LCM. סמן את תאי העצב באמצעות כלי הציור.
- מבצע לכידת לייזר של אזורים אלה באמצעות דיוק מבוקר מחשב ואוטומציה בתהליך בן שני שלבים. ראשית, IR (אינפרא אדום) הוא ירה בנקודות מרובות עם הגדרת חשמל לייזר של 70 mW ודופק של 2,500 μsec כדי לקבל הקרום לצרף את הכובע. בשלב בא, באזור המסומן הוא נכרת באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 mV.
- שילוב של תהליכים אלה באופן סלקטיבי לוכד את האזורים המסומנים מן הקרום PEN על כובעי מאקרו CapSure LCM. כאשר הכובע הוא הרים, הקרום עם neurons שומרת על הכובע.
- בודד RNA הכולל דגימות LCM באמצעות ערכת PicoPure RNA בידוד (ארקטורוס) ולטפל עם DNase.
- להגביר את RNA הבודד באמצעות ערכת ההגברה RiboAMP RNA הבאה הוראות מהערכה.
- לבצע ניתוח בזמן אמת RT-PCR באמצעות בדיקות TaqMan לזהות שרשרת כבדה neurofilament האנושי (hNFHc).
קיצורים:
לספירה, מחלת אלצהיימר; BDNF, גורם נוירוטרופי שמקורם במוח; CREB חלבון, מחזורי אלמנט תגובת AMP מחייב; DBC, AMP המחזורי Dibutyryl; EGF, גורם הגדילה באפידרמיס, FGF, גורם גדילה פיברובלסטים; GFAP, חלבון חומצי fibrillary גליה; LCM, לייזר ללכוד microdissection; NGF, גורם גדילה עצבי; NPC, neuroprogenitor תא; PEN, naphthalate פוליאתילן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרחבת NPCs (איור 1)
כאשר neurospheres מפורקים להשעית תא בודדת על ידי טחינה דקה, קצה פיפטה צריך לגעת בתחתית של התחתית, כך שיש התנגדות מסוימת, כאשר השעית pipetted למעלה ולמטה. את מספר הפעמים של טחינה דקה ינוע בין יחידים וצריך להיות מוכרע על ידי ניסוי וטעייה על ידי בחינת ההשעיה תא וכתוצאה מכך מתחת למיקרוסקופ. זה קריטי כדי לספק צפיפות מספקת של השעיה תא בגלל הריבוי יהיה בקצב מהיר יותר כאשר NPCs בא במגע קרוב. אם NPCs לא גדל, צפיפות התאים צריכה להיות מוגברת על ידי צמצום מספר צלוחיות. אנחנו כבר הצלחנו להרחיב neurospheres עד 10-15 קטעים. אספקה כך שפע של NPCs אדם יכולה להיווצר, הפחתת השימוש ברקמה עוברית אנושית. להמשך האספקה NPCs ונוירונים, רצוי להרחיב אותם תחילה ל3-4 קטעים ולאחר מכן, מחצית NPCs ניתן להרחיב כמו neurospheres ואת החצי השני יכול להיות מובחנת לניסויים מתמשכים. לחלופין, NPCs ניתן גם הרחיב לעוד קטעים, קפואים בחנקן נוזלי כמו במקרה של שורות תאים ליצור היצע גדול יותר של מניות, וקם לתחייה בעת הצורך. זה גם רצוי לבצע ניסויים עם נוירונים הנגזרים מקבוצות שונות של NPCs.
עצבי דיפרנציאציה של NPCs (איור 2)
NPCs הם תאי multipotent ויכול להיות מובחן לנוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes בהתאם לתנאי התרבות. פרוטוקול הבידול שלנו מעורב זריעה של ישנה neurospheres 4 ימים במנות מצופים (איור 2 א). הבחנו כי זה חיוני לזרע צפיפות מספקת של neurospheres כך שנוירונים ההבחנה פזורים ויוצרים רשת צפופה של תהליכים עצביים. תמונות אחרי 1 (איור 2 ב) ו -4 ימים (איור2C יור) של זריעה מוצג. תרבויות נוירון עשיר מניב נוירונים 80-90% והאסטרוציטים 10-15%, התקבלו לאחר ההתמיינות של NPCs בנוכחות שילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לשבועיים (איור 2 ד). למיטב ידיעתנו, בפרוטוקול שתואר במחקר זה להבחנה עצבית לא דווח בעבר על ידי אחרים. באזורי צפיפות נמוכה, NPCs מובחן להאסטרוציטים (2E איור). כדי להשיג תרבות astrocyte עשיר, יכול להיות מתורבת NPCs בנוכחות CNTF (10 ng / ml) ובהעדרו של NGF, BDNF, DBC וחומצה הרטינואית. לכן הרכב נוירון astrocyte ניתן להשפיע במהלך התמיינות בהתאם למטרת הניסוי.
אפיון של בדיל נוירונים (איור 3)
כדי להמשיך ולאפיין NPCs המובחן אלה, ביצענו immunostaining הכפול עבור סמנים עצביים wpolyclonal ה-i ונוגדנים חד שבטיים, ואחרי חשיפה לנוגדנים משני ארנב ועכבר קשור לCy3 (אדום) וFITC (ירוק), בהתאמה. הסמנים עצביים הבאים זוהו: איור 3 א:. NeuN וsynapsin איור 3:. כולינסטרז אצטיל (AChE) וsynaptophysin איור 3 ג: BDNF וGAP43. לכן, יש לי NPCs המובחן המאפיינים של נוירונים עיקרי. בנוסף, סמני astrocyte STAT3 וGFAP התגלו באוכלוסייה קטנה של תאים (איור 3 א). לכן שיטות נוספות יש צורך בניתוח ביטוי גני נוירון הספציפי.
Microdissection לכידת לייזר (LCM) של נוירונים (איור 4)
למרות LCM יכול לשמש לבידוד של תאים ממנת תרבות, הניסיונות הראשוניים שלנו של LCM עם הנוירונים נכשלו משום שהם מחוברים בחוזקה לכלים מצופים. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו מובחנים o NPCsn שקופיות עם מוסיף קרום PEN מצופה פולי-L-ליזין וlaminin עכבר. השקופיות הונחו בתוך צלחת 100 מ"מ תרבית תאים (איור 4 א). ההסדרים של שקופית קרום PEN וכובעי LCM מוצגים באיור 4. תרבויות היו מוכתמות בכתם HistoGen (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים (איור 4C). השקופיות הוצבה במיקרוסקופ במכשיר ארקטורוס ריטאס. נוירונים כדי לנפול בפח היו מסומנים עם כלי ציור (איור 4D). כובעי CapSure HS הונחו על קרום PEN. באמצעות שילוב של חיתוך לייזר UV ולכידת לייזר IR, האזורים המסומנים נאספו על הכובע. נוירונים שנתפסו מוצגים בכובע בנמוך (איור 4F) והגדלה גבוהה (איור 4F).
איור 1.הרחבת NPCs האנושי. א NPCs היה בתרבית בתרחיף ב T75 צלוחיות כneurospheres. B. כאשר neurospheres הגיעה לגודל של 300-500 מיקרומטר, הם הועברו ל15 מיליליטר צינורות וcentrifuged ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות. ג supernatant הושלך ו התא גלולה ב μl 200 בינוני הועבר לצינורות Eppendorf וtriturated. ד neurospheres מוכנה לפצל מוצגות. neurospheres הבורה E. הבא טחינה דקה מוצגות.
איור 2. בידול של NPCs האנושי. א neurospheres נשברה על ידי טחינה דקה ותרבית למשך ארבעה ימים כדי לייצר neurospheres החדשה. Neurospheres בן יומו ב 'ארבעה היו זורעים במנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר. ג דיפרנציאליtion של NPCs נצפה בנוכחות של NGF, BDNF, DBC וחומצה הרטינואית בשלושה ימים לאחר זריעה. תרבות ד Neuron עשירה הושגה לאחר שבועיים. ה NPCs מובחנת להאסטרוציטים באזורי צפיפות נמוכה. פ NPCs מובחן לתרבות astrocyte עשיר בנוכחות CNTF (10 ng / ml) ובהעדרו של NGF, BDNF, DBC וחומצה הרטינואית.
איור 3. עצבי וסמני astrocyte בNPCs האנושי המובחן. NPCs מובחן במשך שבועיים היו קבועים כפול immunostained למטרות שצוינו בpolyclonal ונוגדנים חד שבטיים, ואחרי חשיפה לנוגדנים משני ארנב ועכבר קשור לCy3 (אדום) וFITC (ירוק), בהתאמה. הסמנים עצביים הבאים זוהו: א NeuN וsynapsin.כולינסטרז ב אצטיל (AChE) וsynaptophysin. ג BDNF וGAP43. בנוסף, סמני astrocyte הבאים זוהו: ד STAT3 וGFAP.
איור 4. microdissection ללכוד לייזר של נוירונים. NPCs א הובדל בשקופית קרום PEN המצופה ליזין L פולי וlaminin עכבר. השקופיות הונחו בתוך צלחת תרבית תאי 100 מ"מ. ב ההסדרים של שקופיות PEN קרום וכובע LCM במכשיר ארקטורוס ריטאס מוצגים. תרבויות ג הוכתמו כתם HistoGen (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים. ד נוירונים להישבות סומנו בכלי ציור. נוירונים שנתפסו מוצגים בכובע בנמוך (E) ומגנים גבוהים (F)fication. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים במחקר זה מודל הנוירון עשיר בתרבית תאים בהתמיינות של תאי neuroprogenitor אנושיים עצמי חידוש ושיטה לבודד את אוכלוסייה טהורה של תאי עצב על ידי microdissection ללכוד לייזר. יש לנו השתמשתי בשילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לבידול עצבי של NPCs. DBC משמש להפעלת CREB, גורם שעתוק שמשפר את הנוירוגנזה 12. חומצה הרטינואית גורמת ליציאת מחזור התא ומפחיתה את אוכלוסיית גליה 13. השיטה המתוארת במחקר זה משלבת שינויים על הדוח הקודם שלנו 14. אנחנו קודם לכן השתמשנו בצעד של triturating neurospheres להשעית תא בודד ולאחר מכן זריעתו בצלחות מצופים. זה יכול להוביל לבידול עצבי לא יעיל באזורי צפיפות הנמוכה (2E איור). עכשיו יש לנו הצגנו את ההליך של זריעת neurospheres הקטנה בן ארבעת הימים (איור 1), כדי להבטיח קשר בין דיפרנציאלינוירונים ting (תרשים 1C). בנוסף, תוסף הבידול (גזע טכנולוגיות ניידים) מוחלף בתוסף B27 (Invitrogen), 4-5 ימים לאחר זריעה. השיטה הנוכחית מניבה נוירונים 80-90% באופן עקבי. נוירונים אלה עם רשת ענפה של תהליכים יכולים להישמר בתרבות ל2-3 חודשים, יש יתרון ברור על פני המודל העצבי כתוצאה מהתמיינות של שורות תאי נוירובלסטומה אנושיות. Immunostaining במשך כמה סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43 נצפו עם NPCs המובחן (איור 3). STAT3 וGFAP, סמנים של האסטרוציטים היו גם זוהו באוכלוסייה קטנה של תאים. על ידי הגדלת הריכוז של חומצה רטינואית ל2-5 מיקרומטר, אוכלוסיית astrocyte ניתן להפחית עוד יותר. עם זאת, לא יכולות להישמר תרבויות כזה למשך תקופה ארוכה, כי תאי גליה לתמוך הישרדות עצבית על ידי הפרשה של גורמי גדילה. יש לנו ציינו כי היארצוי להגביר את הריכוז רטינואית 3-5 ימים לפני ביצוע הניסויים.
הטבע הטרוגנית של נוירונים הבדיל מציב אתגרים במונחים של קביעת פרופיל ביטוי גנים של תאים מסוג ספציפי. לכן, יש לנו מותאם לתנאי LCM של נוירונים בתרבית (איור 4). במחקר הנוכחי, אנו מובחנים NPCs בשקופיות עם מוסיף קרום PEN וLCM בוצע בגלל טכניקה זו הוצגה קשיים עם נוירונים בתרבית על מנות תרבית תאים רגילות כפי שהם מחוברים בחוזקה. למרות שהמטרות של LCM יכולות להיות נפגשו על ידי ניתוח immunohistochemical, LCM מציע מספר יתרונות, כולל היכולת להגביר את האות ברמת RNA, לבצע ניתוח זמנית, וכימות מדויק. בשילוב עם microarray, LCM מאפשר ניתוח ביטוי של אלפים גנים בתאים מסוגים שנבחרו 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הצטיינות סקירה (NEUD-004-07F) מהמנהל הוותיקים (לSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T.
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
