Artículo de método

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

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DOI:

10.3791/50561

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6 de enero de 2014

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

En este artículo

Resumen

Evaluada en huéspedes inmunocompetentes singenéticos, la vacuna de células dendríticas (DC) basada en células madre cancerosas (CSC) demostró una inmunidad antitumoral significativamente mayor que las vacunas tradicionales de DC pulsadas con células tumorales a granel heterogéneas.

Resumen

Identificamos la célula madre del cáncer (CSC) - poblaciones enriquecidas del melanoma murine D5 syngeneic a los ratones C57BL/6 y el cáncer squamous SCC7 syngeneic a los ratones de C3H usando ALDEFLUOR/ALDH como marcador, y probamos su inmunogenicidad usando el lysate de la célula como fuente de antígenos a las células dendríticas del pulso (DCs). Los DCs pulsados conlos altos lysates del CSC de ALDH indujeron inmunidad antitumores protectora perceptiblemente más alta que los DCs pulsados con los lysates de los lysates enteros unsorted de la célula del tumor en ambos modelos y en un ajuste de la metástasis del pulmón y un s.c. Ajuste del crecimiento del tumor, respectivamente. Este fenómeno era debido a las respuestas anti-CSC vacuna-inducidas y celulares del anti-CSC del CSC. En particular, los esplenocitos aislados del huésped sometido a la vacuna CSC-DC produjeron una cantidad significativamente mayor de IFNγ y GM-CSF que los esplenocitos aislados del huésped sometidos a la vacuna de lysate de células tumorales no clasificadas de CC pulsada. Estos resultados apoyan los esfuerzos para desarrollar una vacuna terapéutica CSC-basada autóloga para el uso clínico en un ajuste ayudante.

Introducción

Las células madre cancerosas son relativamente resistentes a la quimioterapia y radioterapia convencionales1,2. Por otro lado, esta población de células podría ser la responsable de la recaída y progresión de los cánceres después de las terapias tradicionales contra el cáncer1-4. Debido a la falta de expresión de antígenos tumorales diferenciados en las células madre cancerosas, las células madre cancerosas pueden escapar de las intervenciones inmunológicas actuales de terapia para el cáncer, que están diseñadas principalmente para atacar los antígenos en las células tumorales diferenciadas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas específicamente y destruyendo las células madre cancerosas puede tener promesas para aumentar la eficacia terapéutica del tratamiento actual del cáncer. Con este fin, se aislaron células madre cancerosas (CSC)-poblaciones enriquecidas a partir de dos tumores animales (melanoma D5 y cáncer de células escamosas SCC7), y los utilizamos como fuente de antígeno para pulsar las células presentadoras de antígeno (células dendríticas, DC) para preparar la vacuna CSC-TPDC. A continuación, se evaluó la inmunidad antitumoral inducida por la vacuna CSC-TPDC en los huéspedes inmunocompetentes singenéticos, ratones B6 y ratones C3H, respectivamente. La eficacia antitumoral inducida por CSC-TPDC se comparó con la vacuna tradicional de DC pulsada con linsato de células tumorales heterogéneas no clasificadas (H-TPDC), que ha sido utilizada previamente por nuestro grupo5,6,así como por otros investigadores7 tanto en estudios preclínicos como en ensayos clínicos.

Protocolo

1. Tinción de ALDEFLUOR

  1. Preparación de muestras celulares: Prepare la suspensión unicelular de células tumorales, ya sea de células tumorales cultivadas o de muestras de tumor recién recolectadas. Cuente las células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 x 106 células/ml en el tampón de ensayo ALDEFLUOR.
  2. Etiquete cuatro tubos de ensayo de poliestireno de 12 mm x 75 mm como tubos de control de la siguiente manera: #1: No manchados, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR más DEAB, y #4: 7AAD.
  3. Para estos tubos de control, coloque la suspensión celular de 1 ml en #1 y #4, pero 2 ml en el tubo #2. Agregue 5 μl de DEAB (inhibidor de ALDH) en el tubo #3 y manténgalo en el hielo. A continuación, añadir 10 μl de sustrato ALDEFLUOR activado al tubo #2, mezclar y transferir inmediatamente 1 ml de la mezcla al tubo #3.
  4. Al mismo tiempo, añadir 2 μl de sustrato ALDEFLUOR activado por millón de células al resto de las células (tubos de muestra) también a 1 x 106 células/ml en el tampón de ensayo ALDEFLUOR.
  5. Incubar tanto los 4 tubos de control como los tubos de muestra durante 30 min en un baño de agua de 37 °C.
  6. Después de la incubación, agregue 5 μl 7AAD en el tubo de control #4, y 1 μl 7AAD 1 x 106 células al tubo de muestra. Incubar 10 min a 4 °C.
  7. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 250 x g y retirar el sobrenadante.
  8. Células resuspend en el buffer del ensayo de ALDEFLUOR.
  9. Realice la clasificación citología-basada del flujo.
  10. Establezca las puertas de clasificación utilizando células teñidas de ALDEFLUOR tratadas con DEAB como control negativo y las células teñidas de yoduro de propidio (PI) 7AAD- para el control de viabilidad. Sobre la base de estos controles, se estableció una puerta para distinguir las células ALDEFLUOR+/ALDHde alto,D5 y SCC7. Estas puertas se utilizarán para clasificar todas las células de muestra preparadas anteriormente para las células ALDEFLUOR+/ALDHaltas D5 y SCC7.

2. Preparación de la vacuna de células madre de células madre de células cancerosas de células dendríticas de pulso (CSC-TPDC)

  1. Eutanasia de ratones (singenéticos B6 y C3H, respectivamente) usando CO2 y aislar los huesos del fémur y la tibia.
  2. Ponga los huesos en etanol al 75% durante 1 min a temperatura ambiente. Luego lave los huesos usando HBSS.
  3. Corte la cabeza de los huesos y use una aguja de 21 G y una jeringa de 10 ml para empujar las células en un plato.
  4. Aspirar y soplar las células usando la jeringa para hacer la suspensión unicelular.
  5. Después de la centrifugación en 1.500 rpm durante 5 min, deseche el sobrenadante. A continuación, añadir 5 ml de tampón de lisis RBC a la lisis del RBC durante 1 min en un baño de agua de 37 °C.
  6. Cuente el número de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 millón de células/ml en medio completo (CM) que contenga 10 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4.
  7. Cultíe las células y compense el cm más IL-4 y GM-CSF 3 días más adelante.
  8. Al5º día, coseche las células dendríticas inmaduras (DC) y prepare el medio de aislamiento de CC que contiene 4,2 ml de solución C más 1 ml de medio de gradiente de densidad OptiPrep.
  9. Suspenda los pellets celulares en 5 ml CM. Añadir la suspensión celular en el medio de aislamiento lentamente. Centrífuga a 2.000 rpm a temperatura ambiente.
  10. Recoja los controladores de dominio entre el CM y el medio de aislamiento. Cuente el número de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de 1 millón de células/ml en un medio de cultivo que contenga 10 ng/ml GM-CSF y 10 ng/ml IL-4.
  11. Prepare los lisatos tumorales suspendiendo las células D5 o SCC7altas o no clasificadas de ALDH en medio de cultivo y sujetas a exposiciones rápidas de congelación-descongelación cuatro veces seguidas de espín a ∼100 x g durante 5 min para recolectar la porción de membrana de los lisatos.
  12. Para preparar CSC-TPDC, pulse ADC con el lysate de célulasaltas autólogas de ALDH. Para preparar H-TPDC, pulse los CONTROLADORES DE DOMINIO con el lisato heterogéneo no clasificado de células tumorales. La proporción de DC a la célula tumorallysate es la misma.

3. Vacunación y evaluación de la eficacia

  1. Vacunar ratones B6 normales respectivamente con 2.500 células tumorales D5 CSC-TPDC o D5 H-TPDC por vía subcutánea(s.c.). Vacunar animales normales de C3H s.c. con 5.000 células tumorales SCC7 CSC-TPDC o SCC7 H-TPDC, respectivamente.
  2. Después de la vacunación, desafíe a los ratones B6 con las células heterogéneas del tumor D5 i.v. Euthanize los ratones usando elCO2 20 días más adelante. Cosechar los pulmones y enumerar las metástasis pulmonares.
  3. En el modelo SCC7, desafíe a los ratones C3H con células tumorales SCC7 s.c sin clasificar en el lado opuesto de la vacuna DC. Controle el tamaño del tumor.
  4. Al final de los experimentos eutanasia los ratones B6 y C3H utilizando CO2. En el día 34 después de la primera vacuna, eutanasia ratones con CO2,y al mismo tiempo recoger los bazos de cada grupo con un procedimiento aséptico.
  5. Active las células T y/o B del bazo con los mAb inmovilizados anti-CD3 más los mAbs anti-CD28 en el cm que contiene hrIL-2 o los LPS más las ascitis anti-CD40 (FGK45) del mAb.
  6. Después de la activación, recoger sobrenadantes y utilizar para el ensayo ELISA.
  7. Para el ensayo ELISA, recubre placas con anticuerpos para IFNγ, GM-CSF e IgG a 4 °C O/N.
  8. Después de la aplicación del tampón de bloqueo, agregue muestras y estándares e incube a temperatura ambiente.
  9. Lave la placa y agregue anticuerpos de detección de HRP y sustrato de TMB para la incubación.
  10. Mida la absorbancia en un lector de placas ELISA a 450 nm dentro de los 30 minutos después de detener la reacción.

Resultados

ALDEFLUOR/ALDH se ha utilizado como un solo marcador para aislar células madre en múltiples neoplasias malignas8-11. Identificamos poblaciones célula-enriquecidas madre del cáncer en dos modelos D5 y SCC7 del tumor usando ALDEFLUOR como marcador. Detectamos las células de ALDEFLUOR+ en el melanoma murine B16-D5 y el cáncer de célula squamous SCC7. Encontramos que las células ALDEFLUOR+ contribuyen aproximadamente 0,5% y 5,2% en líneas celulares tumorales D5 y SCC7 cultivadas, respectivamente (Figura 1). Las células tumorales recién cosechadas de tumores establecidos se han analizado para confirmar la existencia de células ALDEFLUOR+. Como también se muestra en la Figura 1,hubo 2,5% y 4,2% de las células ALDEFLUOR+ de tumores D5 y SCC7 establecidos in vivo, respectivamente. La tumorigenicidad y la capacidad de auto-renovación de estasaltas poblaciones clasificadas de D5 y SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH fueron evaluadas en el huésped inmunocompetente singeneico, los ratones C57BL/6 y C3H, respectivamente8.

Se ha utilizado el lisato heterogéneo de células tumorales no clasificadas para pulsos de CDs (H-TPDC) tanto en estudios con animales como en ensayos clínicos5,6. Para examinar la inmunogenicidad de las CSCs, se aisló ALDHalto CSC y pulsado DC con el lisiado de las CSCs a CSC-TPDC generado(Figura 2)y se utilizó H-TPDC como un control convencional de la vacuna contra el cáncer para probar si CSC-TPDC tiene algún efecto beneficioso en la prevención del crecimiento tumoral.

Evaluamos la inmunogenicidad de CSCs examinando la inmunidad antitumores protectora inducida por CSC-TPDC. En el modelo D5, los ratones inmunocompetentes ingenuos fueron vacunados s.c con CSC-TPDC o H-TPDC (en el mismo lisato: cociente de LA C.C.). Los grupos control recibieron solución salina (PBS). Una semana después de la vacuna pasada, desafiaron a los ratones con las células sin clasificar del tumor D5 intravenoso (i.v.),y los pulmones fueron cosechados 3 semanas más adelante para enumerar metástasis del pulmón. Como se muestra en la Tabla 1,en comparación con el grupo PBS, los ratones tratados con el H-TPDC desarrollaron menos metástasis pulmonares. Es importante destacar que los ratones tratados con CSC-TPDC tenían significativamente menos metástasis pulmonares que el grupo de vacunas H-TPDC en ambos experimentos realizados. En el modelo SCC7, los animales normales de C3H fueron vacunados s.c con SCC7 CSC-TPDC o H-TPDC respectivamente en el flanco derecho, seguido por desafiando con las células sin clasificar s.c del tumor SCC7 en el flanco izquierdo. Comparado con el grupo de PBS, H-TPDC indujo inmunidad antitumores modesta contra crecimiento del tumor. Sin embargo, hubo una inhibición significativa del crecimiento tumoral en ratones que fueron tratados con CSC-TPDC en comparación con el grupo control y el grupo H-TPDC (p<0,05, Figura 3). Estos resultados indican que CSCs se podría utilizar como fuente más eficaz del antígeno para cargar DCs que las células sin clasificar tradicionales del tumor en la inducción de inmunidad protectora contra el desafío de las células del tumor.

Para entender más lejos los mecanismos que son la base de la inmunidad antitumores protectora CSC-inducida observada, cosechamos los bazos de los animales sujetados a las vacunas de la C.C. en el final de los experimentos. Las células del bazo entonces fueron activadas por anti-CD3/CD28/IL-2 o anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. A continuación se recogieron los sobrenadantes de cultivo para detectar la expresión de citoquinas y anticuerpos.  Hubo producciones significativamente mayores de IFNγ y GM-CSF por parte de las células del bazo de los animales vacunados con D5 CSC-TPDC o SCC7 CSC-TPDC(Figura 4). Además, había perceptiblemente (p<0,05) una producción más alta de IgG por las células activadas LPS/anti-CD40 del bazo recogidas de los animales vacunados con D5 CSC-TPDC o SCC7 CSC-TPDC comparado con D5 H-TPDC o SCC7 H-TPDC. Estos anticuerpos fueron encontrados para atar a D5 y a SCC7 CSCs respectivamente, y tal atascamiento podría dar lugar a la lisis del CSC en presencia del complemento8.

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Figura 1. Lasaltas poblaciones de ALDHFLUOR+/ALDH fueron detectadas en tumores murine frescos cultivados así como nuevamente cosechados del melanoma D5 y de la célula squamous SCC7. Las células del tumor tratadas con 50 mmol/L DEAB, un inhibidor específico de ALDH, fueron utilizadas como el control negativo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. 

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Figura 2. Generación de vacunas de células madre cancerosas basadas en células dendríticas. Para la preparación de CSC-TPDC y de H-TPDC, las células dendríticas médula-derivadas fueron pulsadas con los lysatesaltos o unsorted de la célula del tumor de ALDH, respectivamente. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. 

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Figura 3. La vacuna de DC pulsada con lysate CSC (CSC-TPDC) podría inducir una inmunidad antitumoral protectora más efectiva en el s.c. Modelo tumoral SCC7. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. 

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Figura 4. Respuestas celulares sistémicas más potentes en el huésped inmunocompetente vacunado con CSC-TPDC.  Los esplenocitos fueron cosechados de los animales sometidos a la vacunación H-TPDC o CSC-TPDC, y se activaron según lo indicado. Los sobrenadantes de la cultura entonces fueron recogidos para la detección del cytokine usando ELISA. Haga clic aquí para ver la imagen más grande. 

Discusión

Los huéspedes immunocompromised, tales como ratones de SCID, imposibilitar evaluaciones inmunológicas de CSCs debido a la carencia de la inmunidad adaptante dentro de los anfitriones. En este estudio, evaluamos el immunogenicity de CSCs en los anfitriones inmunocompetentes, que podrían mímico más de cerca ajustes pacientes. Los CSCs enriquecidos son inmunogénicos y podrían inducir una inmunidad protectora tumoral más efectiva cuando sus lisiados se cargan a los DCs como una vacuna en comparación con los CDC pulsados por lisiado de células tumorales no seleccionadas.  Mecánicamente, la protección fue conferida por la inducción selectiva de anticuerpos CSC-reactivos y de células T8 así como la producción de cytokine del tipo 1, e.g. IFNγ y GM-CSF.

La mayoría de las inmunoterapias actuales, incluidas las vacunas dendríticas basadas en células y la transferencia adoptiva de células T, están diseñadas para atacar antígenos diferenciados por tumores. CSCs, que puede no expresar estos antígenos distinguidos puede por lo tanto escapar de estas blancos inmunológicas. En cambio, la vacuna del CSC diseñada para apuntar específicamente a las células madres del cáncer puede destruir esta población especial de las células cancerosas, y mejorar así la eficacia terapéutica de la vacuna previniendo recaída y la metástasis del tumor.

En células cultivadas del tumor y tumores recientemente cosechados, identificamos a población CSC-enriquecida por el flujo cytometry basado en alta actividad de la deshidrogenasa del aldehído. Tales célulasaltas de ALDH podrían ser aisladas por la clasificación de flujo para ser utilizadas como una fuente de antígeno para pulsar DC para generar CSC-TPDC. Comparación utilizando célulasaltas de ALDH aisladas de células tumorales cultivadas vs de tumores recién cosechados no demostró ninguna diferencia significativa en el término de la inducción de la inmunidad anti-CSC8. Estos resultados revelaron el potencial para utilizar CSCs aislado de las células cultivadas del tumor o de los tumores recientemente cosechados para el uso clínico.

Para ser clínicamente relevante, una vacuna necesita ser examinada en un entorno terapéutico. Estos experimentos se están realizando ahora en nuestro laboratorio.

Divulgaciones

STEMCELL Technologies ha soportado las tarifas de publicación de Acceso Abierto.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Dotado Will y Jeanne Caldwell del Centro Oncológico Integral de la Universidad de Michigan y en parte por la subvención CA82529 de los NIH y la Fundación Gillson Longenbaugh.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ALDHEFLOUR KITStemcell Technologies1700
Murine IL-4Pepro Tech214-14
Murine GM-CSFPepro Tech315-03
Ratón GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep Medio de gradiente de densidadSigma AldrichD1556
BD OptEIA TMB Reactivo Sustrato Conjunto555214BD Biosciences
BD
FACS Aria Clasificador de célulasBD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek Instruments176058
de equipos de

Referencias

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