Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.
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Artículo de método
Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores
En este artículo
Resumen
Resumen
Los métodos para la inmovilización de superficie rápida de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y densidad de inmovilización son altamente deseables para aplicaciones de biosensores y de microarrays. En este estudio, utilizamos una bioorthogonal altamente eficiente covalente [4 +2] reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir la inmovilización de microfluidos de moléculas derivatizadas-Tz TCO / . Supervisamos el proceso en tiempo real bajo condiciones de flujo continuo utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR). Para permitir la inmovilización reversible y ampliar la gama experimental de la superficie del sensor, se combinan un componente de captura de antígeno-anticuerpo no covalente con la reacción de cicloadición. Al presentar alternativamente restos TCO o Tz a la superficie del sensor, múltiples procesos de captura-cicloadición son ahora posibles en una superficie del sensor de montaje y de interacción on-chip de estudios de una variedad de estructuras de componentes múltiples. Nos illustrate este método con dos experimentos diferentes de inmovilización en un chip biosensor; una molécula pequeña, AP1497 que se une la proteína de unión a FK506-12 (FKBP12), y la misma molécula pequeña como parte de una nanopartícula in situ-funcionalizado inmovilizado y en.
Introducción
Reacciones de conjugación eficientes son herramientas valiosas para la fijación de moléculas bioactivas a las superficies para una variedad de aplicaciones de la biotecnología. Recientemente, el bioorthogonal muy rápido [4 2] de reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) se ha utilizado para etiquetar superficies de las células, estructuras subcelulares, anticuerpos y nanopartículas 1. - 7 Aquí, utilizamos el [4 +2] reacción de cicloadición en combinación con la captura de antígeno / anticuerpo (GST / anti-GST) para reversible la síntesis en el chip de estructuras de componentes múltiples para resonancia de pla....
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Protocolo
1. Preparación de GST y nanopartículas (NP) Conjugados
- Preparación GST-TCO:
- Añadir 8 l de solución de TCO-NHS (50 mM en DMSO) a 100 l de GST (1 mg / ml en PBS) y agitar la mezcla a TA durante 1 h.
- Retire el exceso de reactivo utilizando una columna de desalado giro Zeba. El filtrado recuperado que contiene el conjugado de GST-TCO se almacena a 4 ° C antes de su uso.
- Preparación GST-Tz:
- Añadir 6 l de solución de Tz-NHS (25 mM en DMF) a 75 l de GST (1 mg / ml en PBS) y agitar la mezcla a TA durante 1 h.
- Se diluye la mezcla de reacción con 25 l de PBS y se purifica usando una columna de desalación de c....
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Resultados
Los datos y las cifras han sido adaptados de referencia 8.
Inmovilización reversible eficiente de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y la densidad juega un papel clave en el desarrollo de nuevas aplicaciones de biosensores. El uso de la reacción bioorthogonal rápida entre el TCO y Tz, se describe un método para el montaje paso a paso y la regeneración de las superficies de ligando con retención de la actividad biológica. Figura 2 muestra la mon.......
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Discusión
El método de captura-cicloadición aquí descrito permite una rápida inmovilización reversible de las nanopartículas modificadas y pequeñas moléculas para la interacción basada en el chip sin etiquetas y los estudios cinéticos. El protocolo de inmovilización se puede realizar en minutos que requieren <10 M concentraciones de ligandos de molécula pequeña. Mediante la modulación de la concentración de ligando y densidades de inmovilización de tiempo de contacto puede estar estrechamente controlado. Nuestros datos muestra.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Reconocemos la financiación de los NIH (NHLBI Contrato No. HHSN268201000044C a RW, SH y SYS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | |||
| Chip sensor CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Kit de acoplamiento de amina | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Kit de captura de GST | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| Columnas NAP-10 GE | Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, liofilizado en 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R& D Sistemas | 3777-FK | |
| Surfactante P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glicina 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Columna desalinizadora de centrifugación Zeba | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K filtro centrífugo |
| TCO-OH | Ref. 8 | Sintetizado internamente | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Sintetizado internamente, *Disponible comercialmente en Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Sintetizado internamente | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Sintetizado internamente, *Disponible comercialmente en Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Sintetizado internamente | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Sintetizado internamente | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Cuidado de la salud | Biacore T100 |
Referencias
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al.
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Reimpresiones y permisos
