Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

Summary

Sono descritti metodi per la manipolazione e l'analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.

Abstract

L'ippocampo gioca un ruolo fondamentale nella formazione e il consolidamento dei ricordi episodici, ed in orientamento spaziale. Storicamente, l'ippocampo adulto è stato visto come una regione anatomica molto statica del cervello dei mammiferi. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il giro dentato dell'ippocampo è un'area di enorme plasticità negli adulti, coinvolgendo non solo le modificazioni dei circuiti neuronali esistenti, ma anche neurogenesi adulta. Questa plasticità è regolata da reti trascrizionali complesse, in cui il fattore di trascrizione NF-kB gioca un ruolo di primo piano. Per studiare e manipolare neurogenesi adulta, un modello di topo transgenico per l'inibizione neuronale specifico proencefalo dell'attività di NF-kB può essere utilizzato.

In questo studio, sono descritti metodi per l'analisi di neurogenesi NF-kB-dipendente, compresi gli aspetti strutturali, apoptosi neuronale e progenitore proliferazione e significato cognitivo; la cucih specificamente è stato valutato attraverso un giro dentato (DG)-dipendente prova comportamentale, il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale (SPS-BM). Il protocollo SPS-BM potrebbe essere adattato solo per l'uso con altri modelli animali transgenici destinati a valutare l'influenza di particolari geni adulti neurogenesi ippocampale. Inoltre, SPS-BM potrebbe essere utilizzata in altre condizioni sperimentali intesi a studiare e manipolare apprendimento DG-dipendente, ad esempio, utilizzando agenti farmacologici.

Introduction

Ontologicamente, l'ippocampo è una delle più antiche strutture cerebrali anatomiche conosciuti. E 'responsabile di diversi compiti complessi, come le funzioni cardine nella regolazione della memoria a lungo termine, l'orientamento spaziale, e la formazione e il consolidamento della rispettiva memoria. Anatomicamente, l'ippocampo è costituito da strati di cellule piramidali (strato piramidale), tra cui il cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 e CA4), regioni ed il giro dentato (giro Dentato), che contiene granuli e alcuni progenitori neuronali nella propria zona di subgranular . Le cellule granulari proiettano verso la regione CA3 tramite le cosiddette fibre di muschio (assoni delle cellule granulari).

Fino alla fine del secolo scorso, il cervello dei mammiferi adulti è stato creduto di essere un organo statico privo di plasticità e neurogenesi cellulare. Tuttavia, durante gli ultimi due decenni, una crescente quantità di prove dimostra chiaramente neurogenesi adulta si svolgono in almenodue regioni del cervello, la zona subventricolare (SVZ) e la zona subgranulare dell'ippocampo.

I nostri studi precedenti, e quelli di altri gruppi, hanno dimostrato che il fattore di trascrizione NF-kB è uno dei regolatori molecolari cruciali della neurogenesi adulta, e che i suoi risultati de-regolazione di gravi difetti strutturali dell'ippocampo e menomazioni cognitive ^1-6. NF-kB è il nome generico di un fattore di trascrizione inducibile composto da diverse combinazioni dimeriche di cinque-DNA-binding subunità: P50, P52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), gli ultimi tre dei quali hanno domini di transattivazione. All'interno del cervello, la forma più abbondante nel citoplasma è un eterodimero di p50 e p65, che viene mantenuto in una forma inattiva da inibitore di kappa B (IkB)-proteine.

Per studiare e manipolare direttamente neurogenesi NF-kB-driven, usiamo modelli di topi transgenici per consentire semplice inibizione di tutti i subun NF-kBsua, specificamente nel proencefalo ⁷ (vedi figura 1). A questo scopo, abbiamo Incrocio le seguenti linee di topo transgenico, IkB / - e -/tTA. Il transgenico IkB / - linea è stata generata utilizzando un mutante negativo trans-dominante di NF-kB-inibitore IκBa (super-repressore IκBa-AA1) ^8. In contrasto con il wild-type IκBα, IκBα-AA1 è dotato di due residui di serina mutati di alanina (V32 e V36), che ostacolano la fosforilazione e la successiva degradazione del proteasoma dell'inibitore. Per prosencefalo espressione di specifici neuroni del IκBa-AA1-transgene, IkB / - topi sono stati incrociati con i topi ospitare una chinasi calcio-calmodulina-dipendente IIα (CAMKIIα)-promotore che può essere guidato da tetraciclina trans-attivatore (AS) ^9.

p65 topi knock-out hanno un fenotipo letale embrionale, a causa della massiccia apoptosi fegato ^10, quindi l'approccio qui illustrato fornisce un metodo eleganteper indagare il ruolo di NF-kB in postnatale e neurogenesi adulta.

Il test classico comportamentale per studiare l'apprendimento spaziale e la memoria è stata descritta nel 1980 da Richard Morris, un test noto come Morris water-maze (MWM) ^11. In questo open-campo di acqua-labirinto, animali imparano a fuggire da acqua opaca su una piattaforma nascosta basata su orientamento ed extra-labirinto spunti. Una variante secca MWM è il cosiddetto labirinto Barnes (BM) ^12. Questo test utilizza una piastra circolare con 20 fori circolari disposti al confine di un piatto, con un foro definito come una scatola di fuga, e visivi spunti extra-labirinto per l'orientamento. Entrambi i paradigmi sperimentali si basano sul comportamento in volo indotto da un roditore `s avversione per l'acqua, o spazi aperti e luminosi illuminati. Entrambi i test permettono un'indagine di orientamento spaziale, e le prestazioni della memoria correlati. Sebbene l'ippocampo gioca un ruolo generale ed essenziale nella formazione della memoria spaziale, l'ippocampo rEGIONI coinvolti variano a seconda del test applicato. La memoria testato in BM deriva da attività neuronale tra la corteccia enthorinal (CE) ei neuroni piramidali situate nella regione CA1 dell'ippocampo senza il contributo della DG ^13-16. In particolare, il classico BM si basa principalmente sulla navigazione tramite temporo-ammonico percorso monosinaptico da CE III CA1 CE V. È importante sottolineare che il DG è cruciale coinvolto nella cosiddetta pattern recognition spaziale ^17, che non solo comporta il trattamento dei informazioni visive e spaziali, ma anche la trasformazione di rappresentazioni o di ricordi simili in rappresentazioni dissimili, non sovrapposti. Questo compito richiede un circuito tri-sinaptica funzionale da CE II alla DG per CA3 a CA1 e CE VI, che non può essere provato nel BM ^15.

Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato SPS-BM come test comportamentali per verificare specificamente le prestazioni giro-dipendente dentate cognitive in collaborazioneanimali ntrol, e nel modello super-repressore IkB / tTA seguente inibizione di NF-kB. È importante sottolineare che, in contrasto con la MWM o la BM, il SPS-BM può rivelare sottili deficit comportamentali derivanti dal deterioramento della neurogenesi. Poiché spaziale-modello-separazione è strettamente dipendente da un circuito funzionale tra CE II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, questo test è altamente sensibile a potenziali cambiamenti di neurogenesi, modifiche del percorso fibra di muschio o alterazioni dell'omeostasi del tessuto all'interno del DG.

Tecnicamente, il set-up del nostro test si basa sullo studio da Clelland et al., In cui il modello di separazione spaziale è stato testato utilizzando un legno 8-braccio braccio radiale labirinto (RAM) ^19. Nel nostro modificata set-up, le otto bracci sono stati sostituiti da sette identici alimento case gialle. In sintesi, i metodi qui riportate, compresa l'analisi dei DCX (+), le cellule-doublecortin esprimono all'interno dell'ippocampo, le proiezioni in fibra di muschio, neuronale delle cellule death e in particolare la SPS-BM qui presentato, può essere applicato a ricerche di altri modelli del mouse incorporano transgeni che hanno un impatto sulla neurogenesi adulta. Ulteriori applicazioni possono comprendere lo studio di agenti farmacologici e misurare il loro impatto sulla separazione modello DG e spaziale.

Protocol

Dichiarazione Etica

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le disposizioni della utilizzazione cura degli animali e del comitato governativo, LANUV dello stato del Nord Reno-Westfalia, (Düsseldorf, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal LANUV, Düsseldorf sotto il numero di licenza 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare lo stress e il numero di animali necessari per lo studio.

1. Animal Care and Housing

1. Tutti gli animali impiegati nei protocolli qui descritti devono essere tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, come definito dalla Federazione europea Laboratory Animal Science Association (FELASA).
2. I topi dovrebbero essere tenuti in gabbie standard in temperatura e umidità controllata (22 ° C), camera in condizioni diurni (12 ore di luce / buio ciclo) con HEPA aria filtrata.
3. Cibo standardizzato e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum. </ Li>
4. Se / IkB / tTA e IkB - sono utilizzati topi di controllo, la genotipizzazione basato su PCR deve essere eseguita per ogni animale, come descritto in ^{7, 18.}
5. I maschi con una differenza di età di meno di quattro giorni dovrebbe per essere utilizzati per ridurre la variabilità individuale.
6. (OPTIONAL): Per gli esperimenti di riattivazione NF-KB, doxiciclina deve essere somministrato in acqua potabile (2 mg / ml con il 2,5% di saccarosio) per almeno 14 giorni.

2. Spatial modello di separazione-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Tutti i test comportamentali dovrebbe essere effettuata secondo le linee guida internazionali e locali.
2. IMPORTANTE! Utilizzare solo topi maschi con una età di sei mesi o più. La differenza di età tra gli animali di una serie di test deve essere inferiore a quattro giorni. La prova deve essere eseguita dallo stesso operatore per ogni serie. I topi dovrebbe ricevere una dieta standard prima del test per aumentare ulteriormente la motivazione parzialmente guidata da comeweet ricompensa in cibo.
3. Impostare una piastra circolare bianco fatto da plastica dura (diametro 120 cm, vedi figura 5A) in un e umidità ambiente a temperatura controllata (22 ° C), illuminata con almeno 4 x 80 W e 3 x 215 W lampade fluorescenti al neon . IMPORTANTE! Garantire la corretta illuminazione è usata, come la motivazione dei topi per entrare nelle case di cibo è in parte guidato dalla loro avversione per luminose, luoghi esposti.
4. Impostare il sistema video-tracking. La telecamera deve essere posizionata 115 centimetri al di sopra del centro della piastra (vedi figura 5A).
5. Attaccare multicolore spunti extra-labirinto (EMC) per un panno di colore bianco in posizioni ben visibili per gli animali, circa 100 cm dal bordo della piastra (vedi figura 5A).
6. Pulire accuratamente la piastra con un rapido disinfettante che può rimuovere qualsiasi odore dal set-up sperimentale.
7. Posizionare sette identiche case gialle alimentari (12 cm x 7 cm x 8 centimetri, vedere Figura 5A figura 5A).
8. Posizionare dolci ricompense pellet cibo (un quarto di una casa Froot Loop / cibo Kellogs `s) all'interno di tutte le case di cibo sulle posizioni definite (vedi Figura 5A) con una sola casa cibo definito essere liberamente accessibili per l'animale (posizione F, si veda la Figura 5A ). Chiudere le case alimentari non bersaglio con un foglio trasparente.
9. Prima della prova, eseguire assuefazione (un giorno prima di iniziare l'attività). Fai tutte le case alimentari liberamente accessibile e permettere ai topi di esplorare il labirinto liberamente e per recuperare una ricompensa pellet alimentare (10 min / animale).
10. Accendere il computer e la fotocamera e avviare il software di sistema di video-tracking.
11. Avviare la registrazione.
12. Posizionare l'animale al punto iniziale definito sulla piastra circolare (Figura 5A, S: posizione iniziale) e permettere ai topi per cercare la casa cibo di destinazione per 10 min.
13. Stop video-tracking.
14. IMPORTANTE! Pulire la piastra circolare e le case alimentari dopo ogni prova con un rapido disinfettante.
15. Ripetere la prova giorno per sette giorni consecutivi (per animale).
16. Analizzare i risultati (latenza, distanza percorsa e errori) utilizzando il software di statistiche adeguate. Definire gli errori come avvicinarsi alla casa cibo sbagliato e / o contatto con l'apposita casella senza entrare e recuperare la ricompensa pellet cibo. Per l'analisi raggruppati utilizzare ANOVA a due vie con il test di Bonferroni post-hoc.
17. (FACOLTATIVO) Sacrifica i topi e analizzare il dell'ippocampo come descritto di seguito.

3. BrdU Etichettatura

1. Iniettare per via intraperitoneale 50 mg / kg ip BrdU una volta al giorno per 3 giorni (analisi di differenziazione e integrazione) o ip 200 mg / kg per una singola iniezione (analisi della proliferazione).
2. Sacrificare gli animali, sezionare l'ippocampo e preparare 40 sezioni micron come descritto di seguito.
3. Denaturate l'sezioni con 2 M HCl per 10 min e incubare in 0,1 M tampone borato per 10 min.
4. Etichettare una serie uno su dodici di 40 sezioni micron (240 micron a parte) da ciascun animale immunoistochimiche, come descritto di seguito utilizzando anticorpi diretti contro BrdU.
5. Quantificare le cellule marcate mediante analisi al microscopio confocale in tutta l'estensione rostrocaudale dello strato di cellule dei granuli e la zona subgranular. Moltiplicare i numeri risultanti per 12 per ottenere il numero totale stimato di cellule BrdU marcato per ippocampo e dividere per due per ottenere il numero totale di cellule marcate per DG.

4. La rimozione dei cervelli e preparazione di criosezioni da Nonperfused Animali

1. Osservare le procedure approvate a livello locale per eutanasia degli animali. I topi possono essere eutanasia direttamente da dislocazione cervicale.
2. (OPTIONAL) Gli animali possono essere anestetizzati prima euthanization secondo le linee guida locali e internazionali, ad esempio inje intraperitonealection di 0,8 ml Avertin per un mouse 33 g (appena fatto mescolando 150 ml di soluzione fatta di 2,2 mg 2,2,2-tribromoethanol in 1 ml di etanolo isoamyl con 1,85 ml di soluzione fisiologica o tampone fisiologico).
3. Sterilizzare la testa con Betadine (10% povidone-iodio)-garza imbevuta e tampone, successivamente con una garza imbevuta di etanolo al 70%.
4. Decapitare l'animale utilizzando opportuni forbici chirurgiche e tirare la pelle da parte.
5. (OPZIONE) fissatori possono essere adottate per evitare di ripiegamento della pelle ritardato.
6. Effettuare una incisione mediana nel cranio e tirare con attenzione i frammenti di cranio da parte.
7. Rimuovere con attenzione l'intero cervello con uno strumento chirurgico adeguato (ad es Moria Spoon).
8. Preraffreddare 25 ml di 2-metilbutano in un becher da 50 ml (ad es Schott Duran) a -30 a -40 ° C in ghiaccio secco.
   Nota: Per la colorazione libera fluttuazione delle sezioni "spesse", che sono ideali per microscopio confocale a scansione laser, rimuovere il cervello, lavare 3volte in tampone e conservare a 4 ° C in tampone fosfato soluzione di saccarosio al 30% in 50 ml di tubo fino al cervello ha affondato giù alla parte inferiore (tipicamente durante la notte).
9. Posizionare con cura il cervello su un pezzo di Nescofilm (Parafilm) e coprire con grande quantità di composto TissueTek ottobre, congelare il Nescofilm in 2-metilbutano, conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
   Nota: Per la conservazione a lungo tempo a -20 ° C in negozio il 9% di saccarosio, 7 MgCl ₂ mM, 50 mM tampone fosfato, 44% glicerolo.
10. Tagliare il cervello in 10-12 micron di spessore sezioni su appropriate cryomicrotome.
    Nota: Per spessore, sezioni free-floating, congelare cervello su cryotome fase di un'adeguata cryotome (es. Reichert Jung, Frigomobil.) E tagliare 40 micron sezioni orizzontali a -20 ° a - 25 ° C. Raccogliere sezioni da coltello con pennello fine e raccogliere in tampone o mantenere in soluzione di storage (punto 4.9) a -20 ° C per la conservazione a lungo tempo.
11. Montare con cautela due fette su vetrini da microscopio singoli. Il use di vetrini Superfrost UltraPlus è altamente consigliato per massimizzare l'adesione delle sezioni.
12. Essiccare i vetrini per 5 min a temperatura ambiente. I vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.

5. Preparazione di sezioni da irrorati Animali

1. Anestetizzare gli animali come descritto sopra (passo 4.2).
2. Profumato con attenzione l'animale transcardially con tampone fosfato (PBS) contenente eparina (0,025 g/100 ml PBS) e procaina (0,5 g/100 ml PBS) per 2-4 min, seguiti da 4% paraformaldeide in PBS per 10-15 min . Perfusione viene eseguita in modo ottimale mediante perfusione attraverso il ventricolo sinistro e l'apertura dell'atrio destro utilizzando una pressione idrostatica di circa 1,2-1,4 m o utilizzando una pompa peristaltica impostato a circa 15 ml / min. Risultati di perfusione ottimale in un cervello bianco pallido, con vasi sanguigni rossi essere visibile.
3. Sezionare e post-fissare i cervelli in paraformaldeide 4% a 4 ° C per 24 ore.
4. Cryoproteggere i cervelli in saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C per almeno 24 ore.
5. Congelare il cervello sul palco cryotome.
6. Preparare 40 micron sezioni orizzontali di intere forebrains utilizzando un cryotome appropriato.
7. I vetrini possono essere conservati in soluzione crioprotettore (tampone fosfato 0,1 M, 50% glicerolo, 0,14% MgCl _2, 8,6% di saccarosio) a -20 ° C fino all'utilizzo.

6. L'immunoistochimica di sezioni di cervello di Nonperfused Animali

1. Post-fissare le criosezioni, preparate come sopra descritto, utilizzando -20 ° C metanolo freddo per 10 min.
2. Bloccare con siero normale 5% contenente 0,3% Triton-X (dalla specie che è stato utilizzato per sollevare l'anticorpo secondario) per una notte a 4 ° C.
3. Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi primari notte a 4 ° C.
4. Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi secondari a temperatura ambiente per un'ora.
5. Sciacquare 3x con 1x PBS
6. Counterstain la sezione di DNA utilizzando Sytox verde, o DAPI (o un colorante DNA alternativo).
7. Sciacquare 3x con 1x PBS
8. Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento.
9. Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per almeno 48 ore.

7. L'immunoistochimica di sezioni di cervello di perfusione Animali

1. Blocca come descritto nel passaggio 6.2 e successivamente incubare le sezioni di cervello fisse in soluzione di anticorpo primario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (fluttuante) notte a 4 ° C.
2. Risciacquare tre volte con PBS 1x e incubare in soluzione di anticorpo secondario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (liberamente fluttuante) a temperatura ambiente per 3 ore.
3. Sciacquare 3x con 1x PBS
4. Controcolorare la sezione di DNA utilizzando Sytox verde o DAPI (o un colorante DNA alternativo).
5. Lavare tre volte con PBS 1x
6. Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento.
7. Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per unt almeno 48 ore.

8. Indagine su Mossy fibra Proiezioni

1. Sacrificare gli animali, preparare 40 micron sezioni coronali come descritto sopra e macchiare la sezione dell'ippocampo utilizzando un anticorpo per neurofilament M.
2. Scansione delle sezioni alla lunghezza d'onda appropriata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser per visualizzarne le fibre coperte di muschio e nuclei. Avviare la scansione a basso ingrandimento.
3. Utilizzare le immagini a basso ingrandimento per l'orientamento e indirizzare l'ippocampo con le proiezioni in fibra di muschio.
4. Scansione delle sezioni (z-sezionamento) ad alta risoluzione e alto ingrandimento.
5. Analizzare l'aspetto morfologico e la connettività delle fibre muschio visualizzate tramite colorazione per NF-M.
6. (OPTIONAL) Analizzare le dimensioni e il volume di lame dell'ippocampo. Utilizzare il segnale DNA per le misurazioni.

9. Fluoro-Jade C Assay (neuronale morte cellulare)

1. Sacrificare gli animali, sezionare il hippocAmpus, e preparare 12 sezioni micron come descritto sopra.
2. Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Fissare le sezioni in PFA 4% per 40 min a temperatura ambiente.
4. Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH ₂ O.
5. Incubare le sezioni con permanganato di potassio 0,06% (KMnO ₄₎ per 10 min in continuo, agitando delicatamente.
6. Lavare le sezioni 3x con DDH ₂ O.
7. Incubare le sezioni con 0,002% di soluzione Fluoro-Jade C per 20 min a temperatura ambiente.
8. (Opzionale) per colorazioni nucleari simultanee, una soluzione 0,002% Fluoro-Jade C può essere completato con 10 mg / ml DAPI.
9. Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH ₂ O.
10. Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente.
11. Incubare le sezioni con xilene (1 min)
12. Montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene (DPX).

Representative Results

Incroci delle IkB / - linee topo transgenico e tTA porta all'inibizione condizionale dell'attività di NF-kB nell'ippocampo.

Per studiare l'espressione del IκBα-AA1-transgene nel doppio topo transgenico (Figura 1A), i cervelli sono stati isolati, cryosectioned e colorazione con un anticorpo contro GFP (green fluorescent protein). Microscopio confocale a scansione laser rivelato alta espressione del transgene nelle regioni CA1 e CA3, e nella DG (Figura 1B).

Il IκBα-AA1-transgene è espresso in progenitori del tipo 2b, ed è attiva in stati immaturi intermedi e nelle cellule granulari mature.
Per determinare il tipo di cellule prima che esprime il CAMKIIα-driven IκBα-AA1 nella regione dell'ippocampo neurogena, criosezioni di ippocampi da animali IkB / tTA sono state colorate per doublecortin(DCX) e il transgene (GFP). Analisi confocale rivelato GFP-segnali in giovani cellule granulari DCX-positivi, indicando l'induzione dell'espressione del transgene per CAMKIIα-attività (Figura 2, frecce).

Inibizione neuronale NF-kB tramite IκBα-AA1 riduce proiezioni in fibra di muschio, e lo spessore e il volume della DG.

Sezioni coronali di ippocampo di IkB / AS e IkB / - mice sono state colorate per neurofilament M (NF-M) per visualizzare le proiezioni di fibre di muschio, ed rivelano complessi e fascicolare organizzazione (Figura 3). Nei topi IkB / TTA le proiezioni in fibra di muschio sono state gravemente compromesse. Inoltre, l'inibizione di NF-kB portato ad uno spessore lama suprapyramidal significativamente ridotto ed una DG volume inferiore (Figura 3B).

Inibizione neuronale di NF-kB nei topi IkB / tTA porta ad elevata degenerazione neuronalezione, aumento della neurogenesi, e una migrazione disturbato di progenitori DCX-esprimono.

Per studiare le possibili ragioni per le drammatiche difetti strutturali, freschi, fettine di ippocampo non fissate da topi IkB / tTA sono state colorate con Fluoro-Jade C, che consente l'individuazione specifica di morte delle cellule neuronali (Figura 4A). Qui, un drammatico aumento del numero di neuriti degenerativi sono stati osservati in animali transgenici doppia, rispetto ai controlli transgenici singoli. Inoltre, un aumento significativo delle cellule apoptotiche caspasi-3-positivi clivati ​​stato rilevato nei topi IkB / tTA. Al contrario, la colorazione immunoistochimica contro DCX rivelato significativamente aumentata quantità di cellule + DCX nel cervello dei topi IkB / tTA. Inoltre, DCX + cellule IkB / tTA-ippocampi non sono stati organizzati esclusivamente nella zona subgranulare, ma sono stati trovati anche nelle regioni più profonde del DG (Figura 4B), mentre i DCX +-i progenitorin gli animali di controllo sono stati localizzati quasi esclusivamente nella zona subgranulare. Per testare se la quantità aumentata di cellule DCX-esprimono è il risultato della maturazione dei progenitori precedenti o direttamente dovuto proliferazione delle cellule + DCX, BrdU è stato iniettato nella ippocampi di IkB / tTA controllo e topi, che sono stati poi cryosectioned e colorati con DCX e BrdU (Figura 4). Per l'analisi della proliferazione, BrdU è stato iniettato una volta (vedi Figura 4B, regime), seguita da analisi dopo 24 ore. Per l'analisi di differenziazione, tre iniezioni sono state eseguite ogni giorno, seguita da analisi dopo sette giorni. Dopo una singola BrdU-iniezione, sono state osservate differenze significative nel numero totale di cellule BrdU-positive tra IκB/tTA- e animali di controllo, mentre la serie iniezioni approccio a tre ha rivelato una ben maggiore quantità di DCX + cellule / BrdU nella DG di topi IkB / tTA. Questo indica che la differenziazione disturbato o l'integrazione dei DCX-excellule pressanti possono aver causato l'aumento del numero di cellule + DCX, e suggerisce che sono stati coinvolti tipo 3 celle.

Inibizione neuronale dei risultati NF-KB in gravi difetti di apprendimento, come dimostrato dalla Spatial schema di prova Separazione-Barnes Maze. Per verificare in particolare il comportamento del doppio topi transgenici in un compito DG-dipendente, abbiamo usato il SPS-BM, in cui gli animali a differenziare le posizioni con sottili differenze (Figura 5). In questo test comportamentale, i / IkB - animali di controllo esplorate le case alimentari serialmente il primo giorno dell'esperimento (Figura 5). Dopo sette giorni di formazione, gli animali erano in grado di trovare la casa cibo aperta direttamente. Al contrario, gli animali IkB / tTA continuato a esplorare le case di cibo in serie, anche dopo l'allenamento (Figura 5B). L'osservazione di aumenti significativi delle distanze percorse e le latenze superiori e ertassi di ROR negli animali IkB / TTA rispetto alle / IkB - animali di controllo, suggerisce che questi animali avevano difetti di apprendimento gravi (Figura 5C).

Figura 1. Generazione di una inibizione specifica-proencefalo condizionale dell'attività di NF-kB. Disegno A. schematica dei modelli transgenici utilizzati per studiare il ruolo di NF-kB in adulti neurogenesi ippocampale. Calcio-calmodulina dipendente chinasi IIα (CAMKIIα) promotore-driven tetraciclina transattivatore (AS) i topi sono stati usati per regolare l'espressione di un mutante negativo trans-dominante IκBa (IκBa-AA1 super-repressore in IkB topi) combinato con una proteina fluorescente verde tracciante (GFP). Nei topi IkB / tTA, NF-kB è mantenuto nel citoplasma nella sua stazione inattivate da nondegradable IκBa-AA1, che può essere rilevato tramite GFP-fluorescenza. L'inibizione può essere invertito doxiciclina, che inibisce tTA. Espressione del transgene B. Rappresentante in diverse regioni dell'ippocampo dei topi IkB / tTA (CA1, CA3 e DG). Criosezioni sono stati preparati da cervelli isolati di IkB / - e IkB / tTA topi, e sono state fissate e colorate con un anticorpo contro GFP. Si noti che il transgene è altamente espresso all'interno della DG. De: dendriti, DG: giro dentato, ML: strato molecolare; SL: Stratum lucidum. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. Il transgene IκBa-AA1 è espresso in DCX-positive, tipo 2b progenit ors ed è attiva in altri stati intermedi e nelle cellule granulari mature. A. Cryosectioned dell'ippocampo degli animali IkB / tTA con doublecortin (DCX) colorazione e di espressione GFP rivelano espressione del transgene nelle cellule giovani granuli DCX-positive (frecce). DG: giro dentato, ML: strato molecolare di disegno B. Schema di espressione del transgene nelle varie fasi di sviluppo durante lo sviluppo delle cellule dei granuli.. -AA1-transgene IκBa espressione è stata rilevata nei DCX-positive, progenitori del tipo 2b, tutti gli stati immaturi intermedi e nelle cellule granulari mature. Per contro, primi progenitori tipo 1 e tipo-2a (privi DCX-espressione) non esprimono il transgene, e pertanto non sono stati influenzati da inibizione di NF-kB. Modificato dopo Kempermann et al. ²⁰ Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Figura 3. Inibizione di NF-kB porta a proiezioni fibre muschio deteriorati e ad uno spessore ridotto e DG volume in topi IkB / tTA, rispetto al singolo controllo transgenico (IkB / -). A. Immunostaining di ippocampi cryosectioned per neurofilament M (NF-M) per visualizzare le proiezioni in fibra di muschio. In topi di controllo (IkB / -), un'organizzazione complessa e fascicolare di fibre di muschio che collegano le cellule dei granuli alle loro cellule bersaglio in CA3 è evidente, che è stato alterato dopo l'inibizione neuronale di NF-kB nei topi IkB / tTA. Inoltre, l'espressione del super-repressore portato ad uno spessore notevolmente ridotto suprapyramidal lama (confrontare freccia nel pannello di sinistra e destra) e un volume DG diminuita. B. Quantificazione e analisi statistica dei difetti strutturali che comporta l'inibizione di NF-kB. T-test spaiati, a due code. Dati tratti dalla OA-versione di Imielski et al. ² Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4. L'inibizione di NF-kB nei topi IkB / tTA porta ad una maggiore morte neuronale delle cellule, maggiore neurogenesi, e un modello migratorio disturbato di cellule DCX-esprimono. A. Neuron-colorazione specifica Fluoro-Jade C e aumento del numero di cellule caspasi-3-positive spaccati in sezioni di ippocampo rivela un livello più elevato di morte neuronale in topi IkB / tTA che nei IkB / - controlli. Neuriti degenerare sono contrassegnati da frecce e nuclei sono indicati da un asterisco. Sito giusto: quantificazione del spaccati caspasi-3-pocellule sibili all'interno dell'ippocampo suggerisce fortemente aumentato l'apoptosi in animali doppi transgenici. B. La colorazione di criosezioni dell'ippocampo per DCX rivela un aumento del numero di cellule DCX-esprimono negli animali doppi transgenici. Si noti che DCX + cellule IkB / tTA-ippocampi non sono disposti esclusivamente nella zona subgranulare, ma migrate più a fondo nella DG che in IkB / -. Controllo C. Pannello a sinistra: Per verificare l'influenza del transgene sulla proliferazione, una singola BrdU-iniezione è stata eseguita, che ha comportato differenze significative nel numero di cellule BrdU-positive tra IkB / tTA e controlli pannello destro:. Analisi statistica rivelato una significativa aumento delle cellule DCX-esprimono negli animali IkB / tTA dopo tre BrdU-iniezioni giornaliere. L'analisi è stata effettuata sette giorni dopo l'ultima iniezione (test di differenziazione e integrazione). Un aumento significativo BrdU / DCX + è stato rilevato nella DG di Itopi kB / tTA (n = 3). Dati in parte tratti dalla OA-versione di Imielski et al. ² Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5. Set-up e risultati tipici delle spaziale del modello di separazione-Barnes maze (SPS-BM). A. sinistra: Schema del set-up sperimentale. Sette case identiche alimentari (stesso colore, dimensione e forma) sono stati collocati simmetricamente sui punti definiti di un piatto fatto in casa rotonda costruita dal disco di plastica inerte (diametro di 120 cm), con un posto libero (punto di partenza, S). Multicolore spunti extra-labirinto (EMC) sono fissati a fronte di un panno di colore bianco in posizioni facilmente visibili agli animali, circa 100 cm dal bordine della piastra. Per evitare di orientamento per l'odore, pellet cibo si depositano in ogni casa, ma solo una casa cibo è accessibile (chiusura fatta di pellicola trasparente). A destra: Videocamera focalizzata sulla piastra (distanza piastra: 115 centimetri), e una fotografia del set-up, tra cui gli spunti extra-labirinto B. tipico risultato sperimentale di un test SPS-BM.. Il IkB / - animale controllo esplora le case alimentari in serie il primo giorno della serie di test, e la casa cibo aperta è trovata immediatamente dopo sette giorni di formazione. Al contrario, i topi IkB / tTA rivelano apprendimento più poveri, come dimostra l'esplorazione di serie anche dopo la fase di addestramento C. Confronto dei parametri misurati in SPS-BM in IkB / -. IkB e / tTA animali. Topi doppi transgenici mostrano deficit di memoria significative (n = 9) rispetto ai controlli (n = 8) rispetto alla latenza, distanza percorsa e tasso di errore. Valutazione ANOVA bidirezionale; barre di errore: SEM. Dati in B eC sono state prese da OA-versione di Imielski et al. ² Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Discussion

Neurogenesi adulta, e la possibilità della sua manipolazione attraverso l'inibizione di NF-kB nei neuroni, e la sua riattivazione in seguito con doxiciclina, offre un affascinante sistema di indagini neuroni nel cervello adulto, così come in neuronale de-e ri-generazione . La bellezza di questo sistema è che NF-kB via di segnalazione inibizione dei neuroni non solo si traduce in cambiamenti nella morte neuronale, proliferazione progenitore e migrazione, i cambiamenti strutturali e anatomiche gravi, ma anche nei difetti di apprendimento evidenti. È importante sottolineare che il fenotipo degli animali IkB / tTA può essere sperimentalmente invertito e salvato dopo somministrazione di doxiciclina. Questa reversione del fenotipo comprende aspetti strutturali, e può anche portare ad un miglioramento significativo nell'apprendimento DG-dipendente ^2.

Per garantire un risultato interpretabile per gli esperimenti comportamentali, è fondamentale che solo gli animali maschi con una età differeutilizzare SNO di meno di quattro giorni. Inoltre, tutte le serie di test deve essere eseguito dallo stesso operatore. Per quanto riguarda la sala prove, si consiglia vivamente di eseguire il test in un ambiente acusticamente isolato per evitare lo stress e la perdita di attenzione derivante da fonti di rumore esterne. Per evitare che l'orientamento in base al rilevamento dell'odore invece di spunti extra-labirinto, le case chiuse alimentari non devono essere accessibili per l'animale, e normale circolazione dell'aria e l'odore dovrebbe essere consentito. Inoltre, la piastra utilizzata per il test deve essere costruito in materiale inodore e resistente ai detergenti, e deve essere accuratamente pulito tra esperimenti. Un ulteriore potenziale fonte di variazione sperimentale è l'illuminazione del locale. La sorgente di luce deve essere abbastanza luminoso da consentire l'acquisizione delle immagini, il riconoscimento dei segnali extra-labirinto, e per indurre un comportamento di volo, ma non dovrebbe essere di un'intensità di accecare l'animale. Inoltre, si consiglia di effettuare le prove per ciascun animale, allo stesso tempodi giorno per evitare variazioni circadiani.

Mus musculus ha una discreta capacità di visione che, in condizioni naturali, tra gli altri, utilizzati per individuare i confini territoriali in funzioni di grande impatto visivo (segnali visivi come gli alberi) (Latham et al., Appl. Animale Behav. Sci.. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). In un esperimento classico Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) collocato +6, 0 e -7 diottrie lenti davanti agli occhi del mouse e osservato nessun cambiamento significativo della dimensione dei campi recettivi di cellule gangliari della retina. A causa di questo enorme profondità di stimoli visivi (ad esempio dalla cues extra-labirinto) può essere posizionato su una vasta gamma di distanze di fronte a topi e rimanere a fuoco. Nel nostro approccio, la distanza di segnali extra-labirinto dal punto di partenza era di 30 cm dal bordo della piastra, che è in accordo con la letteratura (ad esempio 140 cm Wong et al., geni del cervello Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

I roditori hanno la tendenza a rimanere vicino alle mura di un campo aperto. Questo comportamento è definito come thigmotaxis (Barnett, SH, Il ratto: uno studio nel comportamento, Aldline editoria, Chicago, pp 31-32, 1963). Un recente studio condotto da O `Leary et al. (Behav. Cervello Ris. 216 (2), 531-542, 2011) ha dimostrato che i topi C57BL/6J hanno mostrato un migliore apprendimento in un labirinto Barnes rispetto a 12 altri ceppi di topi. 28% dei topi testato usato ricerca spaziale, considerando che il 64% utilizza la strategia seriale thigmotactic. Questi dati vale per piccolo labirinto con un diametro di 69 cm e un 15 centimetri parete circostante. Tuttavia, i topi testati su un grande labirinto senza pareti o intramaze spunti, come il nostro setup (diametro di 120 micron) hanno evidenziato in modo affidabile per l'uso di prevalentemente extra-labirinto indicazioni visive (si veda ad esempio Bach et al., Cellula. 81 ad esempio causate da differenze microstruttura, la piastra è stata ruotata dopo ogni esperimento.

Il test comportamentale può essere adattato semplicemente per indagare l'impatto di altri fattori di trascrizione sulla neurogenesi ippocampale adulta, utilizzando appropriati modelli di mouse. Tuttavia, è principalmente progettato per testare l'apprendimento DG-dipendente (separazione schema spaziale), e può non essere adeguato per lo studio della neurogenesi o la degenerazione neuronale in altre regioni del cervello. A questo proposito, l'uso di SPS-BM è ulteriormente limitata dalla sua DG-specificità (stretta dipendenza di un circuito funzionale tra CE II e DG e CA3 e CA1 e CE VI), e pertanto non devono essere applicate per investigare attività che coinvolgono il monosinaptico CE III - CA1 - CE V - circuito.

Le future applicazioni dei metodi qui descritti possono comprendere lo studio degli effetti dei trapianti di cellule staminali, farmaceutrattamenti tici sulla neurogenesi ippocampale adulta, e l'omeostasi tissutale all'interno dell'ippocampo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining