Summary
NF-KB-bağımlı yetişkin hipokampal nöron manipülasyonu ve analiz için yöntemler tarif edilmiştir. Ayrıntılı bir protokol farelerin bilişsel sonuçların araştırılması için bir dentat girus-bağımlı davranış testi (uzaysal desen ayrılık-Barnes labirent adlandırılır) için sunulmuştur. Bu teknik aynı zamanda, diğer deneysel ortamlarda araştırmaları sağlama yardımcı olmalıdır.
Abstract
Hipokampus epizodik anıların oluşumu ve konsolidasyon önemli bir rol oynar, ve mekansal yönde. Tarihsel olarak, yetişkin hipokampus, memeli beyin, çok statik bir anatomik bölgesi olarak incelendi. Ancak, son bulgular hipokampusun dentat girus mevcut nöronal devrelerin değişiklikler, aynı zamanda yetişkin nöron sadece içeren, yetişkinlerde büyük bir plastisite bir alan olduğunu göstermiştir. Bu esneklik, transkripsiyon faktörü NF-KB önemli bir rol oynadığı, kompleks transkripsiyonel ağlar tarafından düzenlenir. Yetişkin nöron, NF-KB aktivitesi ön beyin özgü nöronal engellenmesi için bir fare modeli de kullanılabilir çalışma ve işlemek için.
Bu çalışmada, yöntem, yapısal açıdan, nöronal apoptoz ve progenitor çoğalması ve bilişsel önemi, hangi içeren NF-KB-bağımlı nöron analizi tarif edilmektedirh özellikle kıvrımlarının (DG)-bağımlı davranış testi, mekansal desen ayrılık-Barnes labirenti (SPS-BM) üzerinden değerlendirildi. SPS-BM protokolü sadece erişkin hipokampal nöron özellikle genlerin etkisini değerlendirmek için tasarlanmış diğer transgenik hayvan modelleri ile kullanım için adapte olabilir. Dahası, SPS-BM farmakolojik ajanları kullanarak, örneğin, DG-bağımlı öğrenmeyi araştıran ve manipüle amaçlı diğer deneysel ortamlarda kullanılabilir.
Introduction
Ontolojik, hipokampus bilinen eski anatomik beyin yapılarından biridir. Bu tür uzun süreli bellek, uzaysal ve ilgili hafızanın oluşumu ve konsolidasyon düzenlenmesinde önemli fonksiyonlar gibi çeşitli karmaşık görevler için sorumludur. Anatomik olarak, hipokampus kendi subgranular bölge içinde granül hücreleri ve birkaç nöronal progenitörlerin içeren cornu ammonis (CA1, CA2, CA3 ve CA4) bölgeleri ve kıvrımlarının (dentat girus), dahil olmak üzere, piramidal hücre tabakası (stratum pyramidale) oluşmaktadır . Granül hücreleri olarak adlandırılan mossy liflerden (granül hücrelerin akson) ile CA3 bölgesine doğru çıkıntı.
Geçen yüzyılın sonuna kadar, yetişkin memeli beyin hücre plastisite ve nöron eksik statik bir organ olduğuna inanılıyordu. Ancak, son iki yılda, kanıtların giderek artan miktarı açıkça yer alıyor yetişkin nörogenezi gösterir en azİki beyin bölgeleri, bölge subventricular (SVZ) ve hipokampus subgranular bölge.
Daha önceki çalışmalar, ve diğer gruplar bu, transkripsiyon faktörü NF-KB yetişkin nöron önemli moleküler düzenleyicilerin biridir ve ağır yapısal kusurlar hipokampal ve bilişsel bozukluklar 1-6 onun de-regülasyon sonuçları olduğunu göstermiştir. NF-KB, beş DNA-bağlayıcı alt birimlerinin farklı dimerik kombinasyonlarından oluşan bir endüklenebilir transkripsiyon faktörünün genel adıdır: p50, p52, c-Rel, RelB ve p65 (RelA), bunlardan son üç transaktivasyon alanları vardır. Beyin içinde, sitoplazma içinde bulunan en bol bir şekilde p50 ve kappa B (IkB)-proteinleri inhibitörü ile bir inaktif halde tutulur p65, bir heterodimerdir.
NF-KB odaklı nöron çalışma ve direkt olarak işlemek için, NF-KB subun tüm basit önlenmesini sağlamak için transgenik fare modelleri kullanmakonun, özellikle ön beyin 7 (Şekil 1). Ve -/tTA - Bu amaçla, biz şu transgenik fare hatları, IKB / çapraz yetiştirilmiş. Transgenik IKB / - hat NF-KB-inhibitörü IκBa (süper-represor IκBa-AA1) bir trans-dominant negatif mutant kullanılarak oluşturulan 8. Yabani tip IκBα aksine, IκBα-AA1 inhibitörünün fosforilasyonunu ve daha sonra proteozomal bozulmasını engelleyebilir alaninler (V32 ve V36) için mutasyona uğramış iki serin kalıntısına sahiptir. IκBa-AA1-transgenin ön beyin nöron-özel ifadesi için, IkB / - fareler fareler, kalsiyum-kalmodulin bağımlı kinaz barındıran çapraz-yetiştirilmiş IIα tetrasiklin trans-etkinleştirici bölgesiyle (tTA) tarafından tahrik edilebilir (CAMKIIα)-promoteri 9.
p65 knock-out fareler nedeniyle masif karaciğer apoptoz 10, bir embriyonik ölümcül fenotip var, bu nedenle burada gösterilen yaklaşımı zarif bir yöntem sağlarpostnatal ve erişkin nöron NF-KB rolünü araştırmak için.
Uzaysal öğrenme ve bellek çalışma klasik davranış testi Richard Morris, Morris su labirenti-(MWM) 11 olarak bilinen bir test tarafından 1980'lerde tanımlanmıştır. Bu açık alanda su labirentinde, hayvanlar yönlendirme ve ekstra labirent ipuçları dayalı gizli bir platform üzerine opak sudan kaçmak için öğrenirler. MWM kuru bir varyant olarak adlandırılan Barnes labirenti (BM) 12'dir. Bu test, bir bir çıkış kutusu olarak tanımlanan delik ve yönlendirme için görsel fazladan-maze ipuçları ile, plakanın sınırında düzenlenmiş dairesel delikler 20 ile dairesel bir levha kullanır. Hem deneysel paradigmalar bir kemirgen `ın su kaçınma, ya da açık, parlak ışıklı mekanlarda tarafından uyarılan uçuş davranış güveniyor. Her iki test uzaysal bir soruşturma ve ilgili bellek performansı sağlar. Hipokampus uzamsal hafıza oluşumunda genel ve önemli bir rol oynamasına rağmen, hipokampal rkatılan egions uygulanan teste göre değişir. BM test bellek enthorinal korteks (EC) ve DG 13-16 bir katkısı olmadan hipokampusun CA1-bölgesinde bulunan piramidal nöronlar arasında nöronal etkinlik ortaya çıkar. Özel olarak, klasik BM esas Önemli olarak, DG önemlisi işleme bölgesinin sadece ima sözde uzamsal örüntü tanıma 17, katılır EC V'a CA1 EC III monosinaptik temporo-amonik yolu ile gösterime dayanır görsel ve mekansal bilgi değil, aynı zamanda farklı, örtüşmeyen gösterimleri içine benzer temsilleri veya anıları dönüşüm. Bu görev CA1 ve BM 15 test edilemez AT VI, için CA3 için DG EC II fonksiyonel bir tri-sinaptik devre gerektirir.
Bu sorunları çözmek için, biz özellikle co dentat girus bağımlı bilişsel performansını test etmek için bir davranış testi olarak SPS-BM tasarladılarntrol hayvan ve NF-KB inhibisyonu aşağıdaki IkB / tTA süper-represör modelinde. Önemli olarak, MWM ya da BM aksine, SPS-BM nöron düşüklüğü kaynaklanan ince davranışsal hasarları ortaya çıkarabilir. Uzamsal-desen-ayırma EC II ve DG ve CA3 ve CA1 ve AT VI arasında işlevsel bir devre üzerinde sıkı sıkıya bağlı olduğundan, bu test içinde potansiyel nörojenezindeki değişiklikler, yosunlu lif yolunun değişiklikler veya doku homeostasisin değişikliklere son derece hassas DG.
Teknik olarak, bizim test set-up Clelland ve arkadaşları tarafından araştırmaya dayanmaktadır., Mekansal ayrılık desen ahşap 8-kollu radyal kollu labirent (RAM) 19 kullanılarak test edildiği. Bizim modifiye set-up, sekiz silah yedi özdeş sarı gıda evler almıştır. Özet olarak, yöntemler, hipokampus, mossy lif çıkıntılar, nöronal hücre dE içinde doublekortin salgılayan (DCX +) hücre analizleri de dahil olmak üzere, burada gösterilenATH ve özellikle SPS-BM Burada yer, yetişkin nöron üzerinde bir etkiye sahip transgenlerin katıldığı diğer fare modelleri araştırmalar uygulanabilir. Diğer uygulamalar farmakolojik ajanların çalışma ve DG ve mekansal desen ayrılık üzerindeki etkisini ölçmek içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik beyanı
Bu çalışma, toplum ve hayvan bakımı kullanım komitesi, devlet Kuzey Ren-Vestfalya, (Düsseldorf, Almanya) ve LANUV düzenlemeleri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri lisans numarası 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW) altında LANUV, Düsseldorf tarafından kabul edildi. Tüm çabalar sıkıntı ve çalışma için gerekli hayvan sayısını en aza indirmek için yapılmıştır.
1.. Hayvan Bakım ve Barınma
- European Federation Laboratory Animal Science Derneği (FELASA) tarafından tanımlanan, burada tarif edilen protokollere kullanılan tüm hayvanlar, özel patojen içermeyen koşullar altında tutulmalıdır.
- HEPA süzülmüş havası sahip olan fareler, günlük koşullarında (12 saat ışık / karanlık çevrimi) altında bir ısı-ve nem-kontrollü (22 ° C) bir odada standart kafeslerde muhafaza edilmelidir.
- Standart yiyecek ve su ad libitum temin edilmelidir. </ Li>
- IkB / tTA ve IkB / ise - kontrol fareleri kullanılır 7, 18 de tarif edildiği gibi, PCR tabanlı bir genotipleme, her bir hayvan için gerçekleştirilmelidir.
- Az dört gün bir yaş farkı olan erkek hayvanlar bireysel değişkenliği azaltmak için kullanılacak gerekir.
- (İSTEĞE BAĞLI): NF-KB etkinleştirme deneyler için, doksisiklin, en az 14 gün boyunca (% 2.5 sükroz ile 2 mg / ml) içme suyu içinde tatbik edilmelidir.
2. Mekansal Desen Ayırma-Barnes Maze (SPS-BM)
- Tüm davranış testi uluslararası ve yerel kurallara uygun olarak yapılmalıdır.
- ÖNEMLİ! Altı ay veya daha eski bir çağda sadece erkek fareler kullanın. Bir test serisinin hayvanlar arasındaki yaş farkı az dört gün olmalıdır. Test, her seri için aynı operatör tarafından gerçekleştirilmelidir. Fareler ayrıca kısmen olarak tahrik motivasyonunu artırmak için önce test için bir standart diyet almalıdırweet gıda ödül.
- Sert plastikten yapılmış bir beyaz dairesel plaka ayarlayın en az 4 x 80 W ve 3 x 215 W neon floresan lambalar ile aydınlatılan bir nem ve sıcaklık kontrollü bir odada (22 ° C) ve (çapı 120 cm, Şekil 5A bakınız) . ÖNEMLİ! Farelerin motivasyon kısmen aydınlık, maruz yerlere kendi kaçınma tarafından yönlendirilen gıda evlere girmek için, doğru aydınlatma kullanıldığından emin olun.
- Video izleme sistemi kurmak. Kamera 115 cm plakasının merkezinde (bkz. Şekil 5A) üstünde olmalıdır.
- Hayvanların, plakanın sınırında yaklaşık 100 cm (Şekil 5A bakınız) kolayca görülebilir pozisyonlarda beyaz renkli kumaş için çok renkli ekstra-labirent ipuçları (EMC) takın.
- Dikkatli deneysel set-up herhangi bir koku kaldırabilirsiniz hızlı bir dezenfektan ile plakasını temizlemeyin.
- Yedi özdeş sarı gıda evler (12 cm x 7 cm x 8 cm, bakınız Şekil 5A yerleştirin (Şekil 5A bakınız) Tümden işaretlenmiş olmalıdır.
- Şekil 5A, tek bir tanımlanmış gıda ev hayvan (konum F serbestçe erişilebilir olmak (Şekil 5A bakınız) tanımlanmış pozisyonlara tüm gıda evlerin içine tatlı gıda pelet ödülleri (bir Kellogs `s Froot Döngü / gıda evin bir çeyrek) bkz yerleştirin .) Şeffaf folyo ile nontarget gıda evleri kapatın.
- Testten önce, alışma (görev başlamadan bir gün önce) gerçekleştirin. Tüm gıda evler serbestçe erişilebilir yapın ve fareler serbestçe labirenti keşfetmek ve bir gıda pelet ödül (10 dk / hayvan) almak için izin verir.
- Üzerinde bilgisayar ve kamerayı açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak.
- Kayda başlayın.
- Dairesel plaka üzerinde tanımlanmış başlangıç noktası (Şekil 5A, S: başlangıç pozisyonu) de hayvan koyun ve fareler 10 dakika boyunca hedef gıda evde aramak için izin verir.
- Stop video izleme.
- ÖNEMLİ! Hızlı dezenfektan ile her deneme sonrasında dairesel plaka ve gıda evler temizleyin.
- (Her hayvan için) yedi gün boyunca günde testi tekrarlayın.
- Uygun istatistik yazılımını kullanarak sonuçları (gecikme, katedilen mesafe ve hatalar) analiz. Yanlış gıda ev ve / veya girme ve gıda pelet ödül almak olmadan uygun bir kutu ile temas yaklaşıyor gibi hataları tanımlayın. Gruplandırılmış analizi için Bonferroni post-hoc testi ile iki yönlü ANOVA kullanın.
- (İSTEĞE BAĞLI) fareler Kurban ve aşağıda açıklandığı gibi hippocampi analiz.
3. BrdU Etiketleme
- 3 gün (farklılaşma ve entegrasyon analizi) ya da tek bir enjeksiyon (proliferasyon analizi) için 200 mg / kg ip boyunca günde bir defa intraperitoneal olarak 50 mg / kg ip BrdU enjekte edilir.
- , Hayvanların Kurban hipokampus incelemek ve aşağıda açıklandığı gibi 40 mikron bölümleri hazırlamak.
- Denatüre10 dakika için 2 M HCI ile bölümler ve 10 dakika boyunca 0.1 M borat tamponu içinde inkübe edilir.
- BrdU karşı antikorlar kullanılarak aşağıda tarif edildiği gibi, immünohistokimyasal olarak, her bir hayvandan 40 um bölümler (ayrı 240 um) bir tek-in-on iki serisi etiketleyin.
- Tanecik hücre katmanlarında ve subgranular zonunun rostro ölçüde boyunca konfokal mikroskopi analizi ile etiketlenmiş hücrelerin ölçmek. DG başına etiketli hücrelerin toplam sayısını elde etmek için iki ile hipokampus ve bölme başına BrdU etiketli hücrelerin tahmini toplam sayısını elde etmek için, 12 ile elde edilen numaralar çarpın.
4. Perfüze olmayan hayvanlardan Brain ve kriyokesitler Hazırlanması çıkarılması
- Hayvanların ötenazi için lokal olarak onaylanmış prosedürlere uymak. Fareler doğrudan servikal dislokasyon ile ötenazi olabilir.
- (İSTEĞE BAĞLI) Hayvanlar periton inje örneğin, yerel ve uluslararası kurallara uygun olarak, ölümden önce anestezi olabilir(taze ya da fizyolojik tuz tamponu 1.85 ml 2.2 mg 2,2,2-tribromoethanol izoamil etanol ml 1 içinde yapılmış 150 ml stok çözelti karıştırılarak yapılan) 33 g bir fare için 0.8 ml olarak Avertin'in şeklinde gösterilmektedir.
- Betadine (% 10 povidon-iyot)-batırılmış% 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile sonradan gazlı bez ve bez ile kafası sterilize.
- Uygun cerrahi makas kullanılarak hayvan başını kesmek ve bir kenara cilt çekin.
- (İSTEĞE BAĞLI) Fiksatörleri geri zekalı cilt katlama önlemek için uygulanabilir.
- Kafatasında bir ensizyon olun ve dikkatli bir kenara kafatası parçaları çekin.
- Dikkatle uygun bir cerrahi alet (örneğin Moria Kaşık) kullanılarak tüm beyin kaldırmak.
- Kuru buz üzerinde -30 ila -40 ° C, 50 ml'lik bir cam kaba (örneğin, Schott Duran) içindeki bir 2-metilbütan ön soğutma 25 mi.
Not: ideal konfokal lazer taramalı mikroskopi için uygundur "kalın" bölümlerinin serbest yüzen boyama için, beyin kaldırmak, 3 yıkamabeyin (tipik olarak gece boyunca) dibine kadar batmış fosfat içinde 4 ° C'de tampon ve mağaza kez 50 ml bir tüp içinde% 30 sukroz çözeltisi tamponlu. - Dikkatle nescofilm (Parafilm) bir parça beyin koyun ve TissueTek Ekim bileşik bol miktarda kapak, -80 ° C'de kullanıma kadar 2-metilbutan, mağaza nescofilm dondurulması.
Not:% 9 sakaroz, 7 mM MgCI2, 50 mM fosfat tampon maddesi,% 44 gliserol içinde -20 ° C bir mağazada uzun süre depolama için. - Uygun cryomicrotome 10-12 mikron kalınlığında kesitler halinde beyin kesin.
Not: Kalın, serbest yüzen kesitler için, (örneğin Reichert Jung, Frigomobil.) Ve -20 ° 40 mikron yatay bölümleri kesmek uygun kriyotomu arasında kriyotomu sahnede beyin dondurmak - 25 ° C. Ince bir fırça ile bıçak bölümleri toplayın ve tampon toplamak veya uzun süre depolama için -20 ° C'de (4.9 adım) depolama çözümü tutmak. - Dikkatle tek mikroskop lamı üzerine iki dilim monte. BiziUltraPlus Superfrost slaytların e çok bölümlerden yapışmasını arttırmak için tavsiye edilir.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca slaytlar kurutun. Slaytlar, kullanılıncaya kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
5. Perfüze Animals Bölümler hazırlanması
- (Adım 4.2) yukarıda tarif edildiği gibi hayvanların anestezisi.
- Dikkatle 10-15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından 2-4 dakika boyunca fosfat tamponlu heparin ihtiva eden tuzlu su (PBS) (0.025 g/100 ml PBS) ve prokain (0.5 g/100 mi PBS) ile transkardiyal hayvan perfüze . Perfüzyon en iyi şekilde yaklaşık olarak 1.2-1.4 m ya da yaklaşık olarak 15 ml / dak 'ya ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanılarak bir hidrostatik basınç kullanarak sol ventrikül ve sağ atriyum açıklığı yoluyla perfüze edilmesi ile gerçekleştirilir. Hiç kırmızı kan damarları görünür olmak bir soluk beyaz beyin Optimal perfüzyon sonuçları.
- Inceleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C 'de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası düzeltin.
- Cryoen az 24 saat boyunca 4 ° C'de PBS içinde% 30 sukroz içinde beyinleri korur.
- Kriyotomu sahnede beynini dondurur.
- Uygun bir kriyotomu kullanarak tüm forebrains 40 mikron yatay kesitler hazırlamak.
- Slaytlar, -20 ° C'de kullanıma kadar, dondurarak saklama çözeltisi (0.1 M fosfat tampon maddesi,% 50 gliserol,% 0.14 MgCI2,% 8.6 sukroz) saklanabilir.
6. Perfüze Hayvanlar Beyin Bölümler İmmünohistokimyası
- 10 dakika boyunca -20 ° C soğuk metanol kullanılarak, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan cryosections, Post-düzeltin.
- 4 ° C de bir gece (ikincil antikor yükseltilmesi için kullanılan türden)% 0.3 Triton-X içeren% 5, normal serum ile bloke
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve 4 ° C de bir gece primer antikorlar ile inkübe
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve bir saat süre ile, oda sıcaklığında, ikincil antikor ile inkübe edin.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın
- CouSYTOX yeşil veya DAPI (ya da bir başka DNA boya) kullanılarak DNA bölümünün nterstain.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın
- Sulu bir ortam içinde gömme bölümleri Embed.
- Gömülü maddenin en az 48 saat boyunca polimerize olsun.
7. Perfüze Hayvanlar Beyin Bölümler İmmünohistokimyası
- Adım 6.2 'de tarif edilen ve daha sonra 4 ° C de bir gece boyunca% 0.3 Triton-X (yüzer) ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi içinde tespit edilmiş olan beyin bölümleri inkübe olarak Block
- 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında,% 0.3 Triton-X (serbest yüzen) ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş sekonder antikor, çözelti içinde inkübe edilir.
- 1x PBS ile 3 kez yıkayın
- SYTOX DAPI, yeşil ya da (ya da bir başka DNA boya) kullanılarak DNA bölümü Counterstain.
- 1x PBS ile üç kez yıkayın
- Sulu bir ortam içinde gömme bölümleri Embed.
- Gömme ortamı için polimerize olsunt en az 48 saat.
8. Yosunlu Fiber Projeksiyonlar Araştırılması
- , Hayvanlar kurban yukarıda tarif edildiği gibi 40 mikron koronal kesitler hazırlamak ve sinir lifi M. antikoru kullanılarak hipokamp bölümü leke
- Mossy elyaflar çekirdek ve görselleştirmek için bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak, uygun dalga boyunda bölümleri tara. Düşük büyütme taramayı başlatın.
- Yönlendirme için düşük büyütme görüntüleri kullanmak ve yosunlu lif projeksiyonları ile hipokampus hedef.
- Yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütme bölümleri (z-bölümleme) tarayın.
- NF-M lekeleme ile görselleştirilmiştir mossy liflerinin morfolojik görünümünü ve bağlantı analiz edin.
- (İSTEĞE BAĞLI) hipokampal bıçaklarının boyutu ve hacmini analiz. Ölçümler için DNA sinyali kullan.
9. Fluoro-Jade C Deneyi (Nöron Hücre Ölümü)
- Hayvanların Kurban, hipokampusunda teşrihAmpus, ve yukarıda tarif edildiği gibi 12 um kesitler hazırlamak.
- Kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin.
- Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca% 4 PFA içinde bölümleri düzeltildi.
- Kısaca bölümler GKD 2 O. ile 3 kez yıkayın
- , Sürekli, yumuşak çalkalama altında 10 dakika boyunca% 0.06 potasyum permanganat (KMnO 4) ile bölümleri inkübe edin.
- Bölümler GKD 2 O. ile 3 kez yıkayın
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 0.002 Floro-Jade C solüsyonu ile bölümleri inkübe edin.
- (İSTEĞE BAĞLI) eşzamanlı nükleer boyamalar için,% 0.002 Flor-Jade C çözeltisi 10 mg / ml DAPI ile takviye edilebilir.
- Kısaca bölümler GKD 2 O. ile 3 kez yıkayın
- Kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin.
- Ksilen ile inkübe bölümleri (1 dakika)
- Bir ksilen bazlı montaj ortamı (DPX) kullanarak bölümleri monte edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IkB / çapraz yetiştirme - tTA ve transgenik fare hatları hipokampta NF-KB aktivitesi şartlı inhibisyonuna yol açar.
Çift transgenik fare (Şekil 1A) 'de IκBα-AA1-transjenin ekspresyonunu incelemek için, beyin izole cryosectioned ve GFP (yeşil floresan protein) karşı bir antikor kullanılarak boyandı. Konfokal lazer tarama mikroskobu CA1 ve CA3 bölgelerde transgenin yüksek ifade ile uyumlu idi ve dg içinde (Şekil 1 B).
IκBα-AA1-transgen tip 2b progenitörlerin olarak ifade edilir ve ara olgunlaşmamış eyaletlerinde ve olgun granül hücrelerinde aktif olmasıdır.
Hipokampal nörojenik bölgedeki CAMKIIα odaklı IκBα-AA1 ifade erken hücre türünü belirlemek için, IkB / tTA hayvanlardan hippocampi cryosections doublekortin için boyandı(DCX) ile transgen (GFP). Konfokal analiz CAMKIIα-aktivitesi, transgen (Şekil 2, oklar) ekspresyonunun indüksiyonunu gösteren, genç DCX pozitif granül hücrelerinde GFP-sinyalleri ortaya koymuştur.
IκBα-AA1 yoluyla nöronal NF-KB inhibisyonu yosunlu lif projeksiyonları ve kalınlığı ve DG hacmini azaltır.
IKB / tTA'nın ve IKB / hipokampus koronal kesitler - farenin yosunlu fiber projeksiyonları görselleştirmek için nörofilaman M (NF-M) için, lekeli ve karmaşık ve fasikül organizasyonu (Şekil 3) açığa alındı. IKB / tTA farelerde, yosunlu lif projeksiyonları ciddi bozulmaktadır. Buna ek olarak, NF-KB inhibisyonu önemli ölçülerde azaltılmış suprapyramidal bıçak kalınlığı ve daha küçük bir hacme DG (Şekil 3B) yol açtı.
IkB / tTA farelerde NF-KB inhibisyonu arasında nöronal, yüksek nöronal Değen yol açarsında, nörogenezi artmış ve DCX-ifade atalarıdır rahatsız göç.
Taze önemli yapısal kusurlar için potansiyel nedenleri incelemek için, IkB / tTA farelerden sabitlenmemiş hipokampal dilimler nöronal hücre ölümünün spesifik algılama (Şekil 4A) sağlar: Floro-Jade C ile boyandı. Burada, dejenere neurites dramatik olarak artan bir dizi transjenik tek kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, çift transgenik hayvanlarda gözlenmiştir. Dahası, bölünmüş kaspaz-3-pozitif apoptotik hücrelerin önemli bir artış IkB / tTA farelerinde tespit edilmiştir. Buna karşılık, DCX karşı immunohistokimyasal lekeleme IkB / tTA farelerinin beyinlerinde DCX + hücrelerinin artan miktarlarda önemli saptandı. , Bundan başka, IkB / tTA-Hipokampuslardan in DCX + hücreleri subgranular bölgesinde özel olarak düzenlenmiş değil, aynı zamanda GM (Şekil 4B) derin bölgelerinde bulundu ise DCX +-i progenitorlarn kontrol hayvanları subgranular bölgesi içinde neredeyse sadece lokalize edilmiştir. DCX-salgılayan hücrelerin artış miktarı önceki progenitörlerinin olgunlaşması ya da doğrudan bağlı DCX + hücrelerinin çoğalmasından bir sonucu olup olmadığını test etmek için, daha sonra BrdU cryosectioned ve DCX ile boyandı IkB / tTA ve kontrol farelerinin Hipokampuslardan, enjekte edildi ve BrdU (Şekil 4). Çoğalma analizi için, 24 saat sonra BrdU analizi ile, sonra, (Şekil 4B, şemaya bakınız) bir kere enjekte edilmiştir. Farklılaşma analizi için, üç enjeksiyon yedi gün sonra analiz, ardından günlük olarak yapıldı. Üç seri bir yaklaşım enjeksiyonlar-dg içinde BrdU / DCX + hücrelerinin açık bir şekilde daha fazla miktarda ortaya çıkarmıştır tek BrdU-enjeksiyonundan sonra, IκB/tTA- ve kontrol hayvanları arasında BrdU-pozitif hücrelerin sayısı açısından önemli bir fark gözlenmiştir IkB / tTA farelerinin. Bu durum rahatsız farklılaşma veya DCX-ex entegrasyonupresleme hücreleri DCX + hücrelerinin artan sayıları nedeniyle, ve tip-3 hücreleri dahil olduğunu göstermektedir olabilir.
Ağır öğrenme kusurları NF-KB sonuç Nöronal önlenmesi, Mekansal Pattern Ayırma-Barnes labirent testi ile gösterildiği gibi. Özel bir DG-bağımlı görev içindeki çift transgenik farelerin davranışlarını test etmek için, biz, SPS-BM, el sayede hayvanlar ince farklılıklarla yerlerde (Şekil 5) birbirinden ayırt etmek gerekir. Bu davranış testte, IkB / - Kontrol hayvanları deney ilk günü (Şekil 5) üzerine seri olarak gıda evler araştırdı. Eğitim yedi gün sonra, hayvanların doğrudan açık gıda ev bulmak mümkün. Buna karşılık, IkB / tTA hayvanlar da eğitim (Şekil 5B) sonra, seri olarak, gıda evleri keşfetmek için devam etmiştir. Kapalı mesafelerde önemli artışlar ve daha yüksek gecikmeleri ve er gözlemIKB ile karşılaştırıldığında / IKB / tTA hayvanlarda ror oranları, - kontrol hayvanlarında, bu hayvanlar ciddi öğrenme kusurları (Şekil 5C) olduğunu göstermektedir.
Şekil 1. NF-KB aktivitesi, bir koşullu ön beyin spesifik inhibisyonu üretimi. Yetişkin hipokampal nöron NF-KB rolünü incelemek için kullanılan transjenik modelleri A. şematik çizimi. Kalsiyum-kalmodulin bağımlı protein kinaz IIα (CAMKIIα) promoter-tahrikli tetrasiklin transaktivatör (tTA) fareler, yeşil floresan protein ile birlikte bir trans-dominant negatif mutant IκBa (IkB farelerde IκBa-AA1 süper represör) ekspresyonunu düzenlemek için kullanıldı tracer (GFP). IkB / tTA farelerde, NF-KB inaktif sta sitoplazma içerisinde tutulurGFP-floresan yoluyla tespit edilebilir bozunmaz IκBa-AA1 tarafından te. Inhibisyon IKB / tTA farelerde (CA1, CA3 ve DG) farklı hipokampal bölgelerde tTA. B. Örnek transgen ifadesini inhibe doksisiklin tarafından iptal edilebilir. Soğuk kısımlar IkB / izole edilmiş beyinlerinden hazırlanan - ve IkB / tTA fareler ve GFP karşı bir antikor kullanılarak, sabit ve boyandı. Transgen yüksek GM içinde ifade edilir unutmayın. De: Dendritler, DG: kıvrımlarının, ML: moleküler katman; SL: Stratum lucidum. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. IκBa-AA1 transgen olarak ifade edilir DCX-pozitif, tip-2b progenit ors ve daha fazla ara Devletleri ve olgun granül hücrelerinde etkindir. Doublekortin (DCX) boyama ve GFP ifade ile IkB / tTA hayvan A. Cryosectioned hipokampi genç DCX pozitif granül hücrelerinin (oklar) transgenin sentezlenmesini ortaya koymaktadır. DG: kıvrımlarının, ML: moleküler tabaka granül hücre gelişimi sırasında çeşitli gelişim aşamalarında transgen ekspresyonunun B. şematik çizimi.. IκBa-AA1-transgen sentezleme DCX pozitif, tip 2b progenitörlerinin, tüm ara olgunlaşmamış eyaletlerinde ve olgun granül hücrelerinde tespit edilmiştir. Buna karşılık, (DCX-ifadesini eksik) erken tip-1 ve tip-2a atalarıdır transgen ifade vermedi ve bu nedenle NF-KB inhibisyonu etkilenmemiştir. Kempermann vd. 20. sonra değiştirilmiş büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. NF-KB inhibisyonu tek transgenik kontrol (IkB / -) ile karşılaştırıldığında, bozulmuş mossy lif çıkıntılar ve daha düşük bir kalınlık ve DG IkB / tTA farelerde hacme yol açar. Nörofilaman M (NF-M) için cryosectioned Hipokampuslardan A. İmmünoboyama yosunlu lif projeksiyonları görselleştirmek için. Kontrol farelerinde (IkB / -), CA3 hedef hücrelere granül hücreleri bağlayan mossy liflerden oluşan bir kompleks ve bölümler halinde organizasyon IkB / tTA farelerde NF-KB inhibisyonu nöronal sonra bozulmuş olduğu, belirgindir. Ayrıca, süper-represörünün ifadesi önemli ölçüde azaltılmış suprapyramidal bıçak kalınlığı (sol ve sağ panelde ok karşılaştırmak) ve azalmış DG hacim. B. Sayımı ve NF-KB inhibisyonu kaynaklanan yapısal kusurları istatistiksel analiz yol açtı. T-test, iki kuyruklu. Ark Imielski ve OA-sürümünden alınan veriler. 2 büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. IkB / tTA farelerde NF-KB inhibisyonu, nöron hücresi ölümü, gelişmiş nöron ve DCX-salgılayan hücrelerin bir rahatsız göç model sebep olur. Kontrol - A. Neuron özgü Floro-Jade C boyama ve hipokampus bölümlerinde ayrıldı kaspaz-3-pozitif hücrelerinin sayısı arttı IkB / daha IkB / tTA farelerde nöronal hücre ölümü daha yüksek bir düzeyde açığa çıkarır. Dejenere neurites oklarla işaretlenmiştir, ve çekirdekler yıldız işaretiyle belirtilmiştir. Sağ site: Yarılan kaspaz-3-po ölçümüHipokampuslardan içinde sitive hücreleri yüksek oranda çift transgenik hayvanlarda apoptosisi artış önerir. DCX için hipokamp cryosections B. Boyama çift transgenik hayvanlarda DCX-salgılayan hücrelerin bir artış olduğunu ortaya koymaktadır. . Kontrol C - IKB / tTA-Hipokampuslardan in DCX + hücreleri subgranular bölgesinde sadece düzenlenmiş, ancak IKB / daha DG derinliklerine geçirilmez unutmayın Paneli Sol:. Çoğalması üzerindeki transgenin etkisini test etmek için, tek bir enjeksiyon BrdU-IkB / tTA ve kontrol grubu arasında BrdU-pozitif hücrelerin sayısı Sağ panel olarak önemli bir fark ile sonuçlanmıştır ki gerçekleştirildi: İstatistiksel değerlendirme, önemli bir açığa Üç gün sonra, BrdU-enjeksiyonlar IkB / tTA hayvanlarda DCX salgılayan hücrelerin artış. Analiz yedi gün, son enjeksiyon (farklılaşma ve entegrasyon testi) sonra gerçekleştirilmiştir. BrdU / DCX + önemli bir artış I GM saptandıkB / tTA fareleri (n = 3). Veri kısmen Imielski vd. 2 OA-sürümünden alınan büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Set-up ve mekansal desen ayrılık-Barnes labirent (SPS-BM) tipik sonuçları. A. Sol: deneysel set-up şematik çizim. Yedi özdeş gıda evler (aynı renk, boyut ve şekil) bir serbest nokta (başlangıç noktası, S) ile, sert bir asal plastik (120 cm çap) inşa yuvarlak, ev yapımı plaka tanımlı noktalar simetrik olarak yerleştirilmiştir. Renkli ekstra-labirent ipuçları (EMC) b hayvanların, yaklaşık 100 cm kolayca görülebilir pozisyonlarda beyaz renkli kumaş önünde bağlandıklarıplaka sırası. Koku yönlendirmesini önlemek için, gıda pelet her evde yatırılır, ama sadece bir yemek evi erişilebilir (şeffaf folyoyla yapılmış kapanması) olduğunu vardır. Sağ:, ve ekstra labirent kuyrukları, bir SPS-BM testi B. tipik deneysel sonuçlar da dahil olmak üzere set-up bir fotoğraf.: Video kamera plaka (115 cm plaka mesafesi) üzerinde duruldu. IKB / - kontrol hayvan deney serisinin ilk gününde seri gıda evleri araştırıyor ve açık gıda evin hemen eğitim yedi gün sonra bulundu. Ve IKB / tTA hayvanlar -. Aksine, IKB / tTA fareler bile eğitim aşamasında IKB / SPS-BM ölçülen parametrelerin C. karşılaştırılması sonra bir seri keşif gösterdiği gibi yoksul öğrenme, ortaya koymaktadır. Çift transgenik farenin önemli hafıza kaybı gösterir (n = 9) kontrol (n = 8), gecikme ile ilgili olarak, mesafe kapalı ve hata oranı ile karşılaştırıldığında. iki-yönlü ANOVA değerlendirme; hata çubukları: SEM. Yatak Veri veC ve ark Imielski ve OA-sürümünden alınmıştır. 2 büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin nöron ve doksisiklin ile nöronlarda NF-KB inhibisyonu, ve daha sonra yeniden aktivasyonu ile kendi manipülasyon olasılığı, yetişkin beyin, hem de nöronal de-ve yeniden üretimi içine yeni doğmuş nöronlar araştırmalar için ilginç bir sistem sunar . Bu sistemin güzelliği olduğu nöronal hücre ölümü, progenitör çoğalma ve yer değiştirme, ve ağır yapısal ve anatomik değişimler değil, aynı zamanda açık bir öğrenme kusurları değişikliklere nöron sonuçlar sadece NF-KB sinyal yolu inhibisyonu. Önemlisi, IKB / tTA hayvanların fenotip deneysel ters ve doksisiklin uygulamasından sonra kurtarıldı olabilir. Fenotip Bu reversiyon yapısal yönlerini içerir ve aynı zamanda DG-bağımlı 2 öğrenme anlamlı iyileşmeye yol açabilir.
Davranışsal deneyler için bir yorumlanabilir sonuç sağlamak için, kritik olduğu bir yaş farkıyla sadece erkek hayvanlaraz dört gün nce kullanılabilir. Ayrıca, tüm test serisi aynı operatör tarafından yapılmalıdır. Test odasına gelince, biz güçlü stres ve dış gürültü kaynaklarından kaynaklanan dikkat kaybını önlemek için bir akustik yalıtılmış ortamda testi önerilir. Bunun yerine ilave-labirent ipuçlarının koku tespiti göre yönlenmesinin engellenmesi için, kapalı gıda evler hayvana erişilebilir olmamalı ve normal hava sirkülasyonu ve koku izin verilmelidir. Buna ek olarak, test için kullanılan levha koku nötr ve deterjan-dirençli bir malzemeden yapılmış olmalıdır ve dikkatli bir şekilde deneyler arasında temizlenmesi gerekir. Deneysel varyasyon bir başka potansiyel kaynağı oda aydınlatma olduğunu. Işık kaynağı görüntü alma, ekstra labirent ipuçlarının tanınmasını sağlayacak kadar parlak olmalı ve uçuş davranış ikna etmek, ancak hayvan kör bir yoğunluk olmamalıdır. Ayrıca, aynı zamanda, her bir hayvan için, deney yapan önermekGünün sirkadiyen varyasyonları önlemek için.
Mus musculus görsel çarpıcı özellikleri (ağaçlar gibi görsel ipuçları) (Latham ve diğ., Appl. Hayvan Behav. Sci. 86. (3-4 de bölgesel sınırlarını tespit etmek için kullanılan diğerleri arasında, doğal koşullarda, bir oldukça iyi bir vizyon yeteneği vardır ), 261-289, 2004). Klasik bir deney Balkema ve ark. (Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982), 0 6 yerleştirilir ve -7 diyoptri fare gözlerinin önünde lens ve retina ganglion hücre içinde açık alan boyutları anlamlı bir değişiklik gözlenmedi. Nedeniyle alan bir görsel uyaranlara (örn. ekstra-labirent ipuçları), bu farelerin büyük bir derinliğe kadar önünde mesafeleri geniş bir aralığı üzerinde yerleştirilebilir ve odak kalır. Bizim yaklaşımda, başlangıç noktasından ekstra labirent ipuçlarının mesafe literatüre uygun olan plakanın sınırında, (30 cm oldu W örneğin 140 cmOng ve diğ., Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)
Kemirgen bir açık alan duvarlarına yakın olacağı eğilimi vardır. Bu davranış thigmotaxis olarak tanımlanır (Barnett, SH, sıçan: davranış bir çalışma, Aldline yayıncılık, Chicago, pp 31-32, 1963). Son zamanlarda O `Leary ve arkadaşları tarafından çalışma. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) C57BL/6J fareler 12 başka farenin suşlara kıyasla Barnes labirent daha iyi öğrenme gösterdiğini gösterdi. % 64 seri-thigmotactic stratejiyi kullandık ise farelerin% 28, mekansal arama kullanılan test edilirler. Bu veriler, bir 15 cm duvar Çevre 69 sm bir çapı olan küçük bir labirent için de geçerlidir. Ancak, fareler duvarlar olmadan büyük bir labirent üzerinde test veya ipuçlarını intramaze, bizim kurulum (120 mikron çapında) güvenilir ağırlıklı ekstra labirent görsel ipuçlarının kullanılması (bkz. örneğin, Bach ve ark., Celi. 81. kanıt gösterildiği gibi Örneğin, mikro yapı farklılıklarından kaynaklanan başka fiziksel ipuçları önlemek için, her bir deney plakası sonra döndürüldü.
Davranışsal Test sadece uygun fare modelleri kullanılarak, yetişkinler için hipokampal nöron diğer transkripsiyon faktörlerinin etkisini araştırmak için uyarlanabilir. Ancak, özellikle DG-bağımlı öğrenme (alansal ayırma) test etmek için tasarlanmıştır, ve nöron ya da diğer beyin bölgelerinde nöronal dejenerasyonun soruşturma için uygun olmayabilir. Bu bağlamda, SPS-BM kullanımı daha da DG-spesifikliği (EC II ve DG ve CA3 ve CA1 ve EC VI arasında işlevsel bir devre üzerinde katı bağımlılık), ve bu nedenle de dahil görevleri araştırmak için uygulanmamalıdır ile sınırlıdır monosinaptik AT III - CA1 - EC V - devresi.
Bu tarifnamede tarif edilen yöntemlerden gelecek uygulamalar kök hücre transplantasyonu, pharmaceu etkilerini araştıran içerebilirhipokampus içinde yetişkin hipokampus nöron ve doku homeostazisindeki tical tedaviler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz mükemmel teknik destek için Angela Kralemann-Köhler teşekkür ederim. Burada açıklanan deneysel çalışmalar bizim laboratuvarımızda gerçekleştirildi ve CK ve BK ve BK Araştırma ve Eğitim Alman Bakanlığı (Bmbf) bir hibe Alman Araştırma Kurumu (DFG) hibelerinden tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-Doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | IHC, Dilution 1:2,000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2,000 |
| Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | Mundipharma | D08AG02 | disinfectant |
| Cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120 cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke Mayr | 113 911 | disinfectant |
| Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | TSE Systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilization/IHC |
| Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40 µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro-Jade C staining |
References
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
