Summary
NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.
Abstract
해마는 일시적인 기억의 형성 및 통합에 중요한 역할을하며, 공간 방향. 역사적으로, 성인의 해마가 포유 동물 뇌의 매우 정적 인 해부학 적 영역으로 조회되었습니다. 그러나, 최근의 연구 결과는 해마의 치아 이랑은 기존의 연결 회로의 수정뿐만 아니라, 성인 신경뿐만 아니라 포함, 성인의 엄청난 가소성의 영역임을 증명하고있다. 이 소성은 전사 인자 NF-κB가 중요한 역할을 담당하는, 전사 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 성인 신경, NF-κB 활성의 전뇌 특정 신경 세포의 억제를위한 형질 전환 마우스 모델을 사용할 수를 연구하고 조작 할 수 있습니다.
본 연구 방법은 구조적 측면, 신경 세포의 사멸 및 전구 확산,인지 의미, whic 포함하여 NF-κB에 의존하는 신경의 분석에 대해 설명합니다H는 특히 치아 이랑 (DG)에 의존하는 행동 테스트, 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM)을 통해 평가되었다. SPS-BM 프로토콜은 단순히 성인 해마 신경의 특정 유전자의 영향을 평가하기 위해 설계된 다른 트랜스 제닉 동물 모델에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 또한, SPS-BM는 약리학 제제를 사용하여, 예를 들면, DG 의존 학습을 조사하고 조작 겨냥한 다른 실험 설정에서 사용될 수있다.
Introduction
론적, 해마는 알려진 가장 오래된 해부 뇌 구조의 하나이다. 그런 장기 기억, 공간 방향, 및 각각의 메모리 형성 및 통합의 조절에 중추적 인 기능 등 다양한 복잡한 태스크를 책임진다. 해부학, 해마는 subgranular 영역 내에서 과립 세포와 약간의 신경 전구 세포를 포함하는 뿔 Ammonis (CA1, CA2, CA3 및 CA4) 지역과 치아 이랑 (dentate gyrus) (이랑 dentatus), 등의 피라미드 세포 층 (지층 pyramidale)로 구성 . 과립 세포는 소위 이끼 섬유 (과립 세포의 축삭)를 통해 CA3 영역을 향해 돌출.
지난 세기 말까지, 성인 포유류의 뇌 세포의 가소성과 신경을 결여 정적 인 기관이 될 것으로 추정했다. 그러나 지난 20 년간, 기록의 성장 양이 명확하게 일어나고 성인 신경을 보여줍니다 이상두 뇌 영역, subventricular 영역 (SVZ) 및 해마의 subgranular 영역.
우리의 이전 연구와 다른 그룹의 사람들은 전사 인자 NF-κB가 성인 신경의 중요한 분자 규제 중 하나이며, 심각한 구조적 해마 결함과인지 장애 1-6에서의 규제 완화의 결과가 있다는 것을 보여 주었다. NF-κB는 다섯 DNA 결합 서브 유닛의 다른 이량 체의 조합으로 구성된 유도 전사 인자의 총칭이다 : P50, P52, C-상대, RelB 및 P65 (상대적), 후자의 세 전이 활성화 도메인이. 뇌 내에서 세포질에서 발견되는 가장 풍부한 형태는 P50와 카파 B (IκB) 단백질의 억제하여 비활성 형태로 유지 P65의 이종입니다.
NF-κB 중심 신경을 공부하고 직접 조작하기 위해, 우리는 NF-κB의 subun의 모든 간단한 억제 할 수 있도록 유전자 변형 마우스 모델을 사용그는 구체적 전뇌 7 (도 1 참조). 및 -/tTA -이를 위해, 우리는 다음의 유전자 변형 마우스 라인 IκB / 교차 사육. 형질 전환 IκB / - 라인은 NF-κB 억제제 IκBa (슈퍼 억제 IκBa-AA1)의 트랜스 지배적 부정적인 돌연변이 체를 사용하여 생성 된 8. 야생형 IκBα 달리 IκBα-AA1은 억제제의 인산화와 후속 프로 테오 분해를 방해 알라닌 (V32 및 V36)에 변이 개의 세린 잔기를 갖는다. IκBa-AA1-유전자의 전뇌 신경 세포의 특정 표현, IκB / - 마우스는 마우스는 칼슘 - 칼 모듈 린 의존성 키나제를 숨겨와 교차 자란 IIα 테트라 사이클린 트랜스 활성제 (TTA)에 의해 구동 될 수있다 (CAMKIIα) 발기인 9.
P65 녹아웃 마우스 인해 대규모 간 세포 사멸 (10), 배아 치명적인 표현형이있다, 그래서 여기에 표시된 방법은 우아한 방법을 제공출생 후 성인 신경에서 NF-κB의 역할을 조사하는.
공간 학습과 기억을 연구하는 고전적인 행동 시험은 리처드 모리스, 모리스 물 미로 (MWM) 11로 알려진 시험에 의해 1980 년대에 설명했다. 이 오픈 필드 물 미로에서, 동물은 방향과 추가 - 미로 단서에 따라 숨겨진 플랫폼에 불투명 한 물에서 탈출을 배웁니다. MWM의 건조 변형은 소위 반스 미로 (BM) 12. 이 테스트는 하나의 탈출 상자로 정의 된 구멍 및 방향에 대한 시각적 여분 미로 단서로, 판의 경계에 배치 (20)의 원형 구멍이있는 원형 접시를 사용합니다. 두 실험 패러다임은 짐승`의 물에 대한 혐오, 또는 오픈, 밝은 조명 공백으로 유도 비행 동작에 의존하고 있습니다. 두 시험은 공간 방향에 대한 조사 및 관련 메모리 성능을 할 수 있습니다. 해마는 공간 기억 형성의 일반적이고 필수적인 역할을하지만, 해마 R참여 egions 적용 시험에 따라 다릅니다. BM에서 테스트 메모리는 enthorinal 피질 (EC)와 DG 13-16의 기여없이 해마의 CA1 - 지역에있는 피라미드 뉴런 사이의 연결 활동에서 발생한다. 특히, 고전 BM은 주로 중요한 것은, DG가 결정적으로 처리뿐만 아니라 의미 소위 공간 패턴 인식 17 일에 관여 EC V.에 CA1에 EC III에서 monosynaptic 측두 - ammonic 경로를 통해 탐색에 의존 시각 및 공간 정보뿐만 아니라, 서로 다른, 겹치지 않는 표현으로 유사한 표현이나 기억의 변형. 이 작업은 CA1과 BM (15)에 테스트 할 수 없습니다 EC VI에 CA3에 DG에 EC II에서 기능 트라이 시냅스 회로가 필요합니다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 구체적으로 공동의 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는인지 성능을 테스트하기 위해 행동 테스트로 SPS-BM을 고안했다ntrol 동물 및 NF-κB 억제 다음 IκB / TTA 슈퍼 억제 모델. 중요한 것은, MWM 또는 BM 대조적으로, SPS-BM은 신경의 손상으로 인해 발생하는 미묘한 행동 적자를 공개 할 수 있습니다. 공간 패턴 분리가 EC II와 DG와 CA3와 CA1과 EC VI 사이의 기능 회로에 엄격하게 의존하기 때문에,이 테스트는 내 잠재적 인 신경의 변화, 이끼 섬유 경로의 수정 또는 조직의 항상성의 변화에 매우 민감 DG.
기술적으로, 우리의 테스트의 셋업은 Clelland 등의 연구를 기반으로합니다., 공간적 분리 패턴이 나무 8 팔 레이디 얼 미로 (RAM) 19를 사용하여 테스트 한에서. 우리의 수정 된 설정에있는 8 개의 팔은 일곱 동일한 노란색 식품 하우스로 대체되었다. 요약하면, 방법은 해마, 이끼 섬유 돌기, 신경 세포 드에게 내 doublecortin 발현 (DCX +) 세포의 분석을 포함하여, 여기에 표시ATH 특히 SPS-BM 여기서 제시된, 성인 신경에 영향을 도입 유전자를 도입 한 다른 마우스 모델 연구에 적용될 수있다. 또한 응용 프로그램이되는 약물의 연구와 DG 및 공간 패턴의 분리에 미치는 영향을 측정을 포함 할 수있다.
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Protocol
윤리 문
본 연구는 정부의 동물 및 관리에 사용위원회, 국가 노스 라인 - 웨스트 팔리 아, (뒤셀도르프, 독일)의 LANUV의 규정에 따라 실시 하였다. 모든 동물 실험은 라이센스 번호 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW)에서 LANUV, 뒤셀도르프에 의해 승인되었다. 모든 노력이 조난 및 연구에 필요한 동물의 수를 최소화하도록 하였다.
1. 동물 관리 및 주택
- 연맹 유럽 실험 동물 과학 협회 (FELASA)에 의해 정의 된 명세서에 기술 된 프로토콜에 사용 된 모든 동물은 무균 상태에서 보관해야합니다.
- HEPA 공기 여과와 마우스는 낮의 조건 (12 시간 빛 / 어둠주기)에 따라 온도와 습도 조절 (22 ° C) 방에 표준 케이지에 보관해야합니다.
- 표준화 된 음식과 물을 임의로 제공한다. </ 리>
- IκB / TTA 및 IκB는 / IF - 대조군 마우스가 사용되는 7, 18에서 설명한 바와 같이, PCR-기반의 유전형은 각 동물에 대해 수행되어야한다.
- 이하 사일의 나이 차이 말레 동물은 개별 변동을 줄이기 위해 사용되는 것이다.
- (선택 사항) : NF-κB의 활성화의 실험을 위해, 독시 싸이클린은 적어도 14 일 동안 (2.5 % 자당 2 ㎎ / ㎖) 마시는 물을 관리해야합니다.
2. 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM)
- 모든 행동 테스트는 국제 및 지역 가이드 라인에 따라 실시해야한다.
- 중요! 6 개월 이상 연령이 만 수컷 마우스를 사용합니다. 하나의 테스트 시리즈의 동물 사이의 나이 차이가 적은 4 일 이상이어야합니다. 테스트는 각 시리즈에 대해 동일한 작업자가 수행해야합니다. 마우스는 또한 부분적으로 구동 동기를 부여하기 전에 테스트에 표준 식단을 받아야한다WEET 음식 보상.
- 하드 플라스틱으로 만든 흰색 원형 접시를 설정 최소 4 × 80 (W)와 3 × 215 W 네온 형광 램프 조명, 습도 및 온도 조절 실 (22 ° C)에 (직경 120cm는,도 5a 참조) . 중요! 마우스의 동기가 부분적으로 밝은 노출 장소에 자신의 혐오에 의해 구동되는 음식의 주택을 입력으로, 올바른 조명이 사용되어 있는지 확인합니다.
- 비디오 추적 시스템을 설정합니다. 카메라는 115cm 플레이트의 중앙 (그림 5A 참조) 위에 배치해야합니다.
- 동물, 판의 경계에서 약 100 센티미터 (그림 5A 참조) 쉽게 볼 위치에 흰색 색 천에 여러 가지 빛깔 추가 미로 큐 (EMC)을 연결합니다.
- 조심스럽게 실험 장치에서 모든 냄새를 제거 할 수있는 빠른 살균제 플레이트를 청소합니다.
- 일곱 동일한 노란색 식품 주택 (12cm X 7cm × 8 cm의 그림 5A를 배치 (그림 5A 참조) 명백하게 표시해야한다.
- 그림 5A에게 단 하나의 정의 음식 집은 동물 (위치 F에 자유롭게 접근 채 (그림 5A 참조) 정의 된 위치에있는 모든 음식을 집 안에 달콤한 음식 펠릿 보상 (Kellogs`의 Froot 루프 / 음식 집의 내무반)를 참조 배치 ). 투명 호일로 비 표적 식품 주택을 닫습니다.
- 시험 전에, 습관화 (작업을 시작하기 전에 하루) 수행합니다. 모든 식품 주택 자유롭게 액세스 할 수있게하고, 마우스는 자유롭게 미로를 탐험하고 식품 펠렛 보상 (10 분 / 동물)를 검색 할 수 있습니다.
- 컴퓨터와 카메라를 전환하고 영상 추적 시스템 소프트웨어를 시작합니다.
- 녹음을 시작합니다.
- 원형 접시에 정의 된 시작점 (그림 5A, S : 시작 위치)에 동물을 배치하고 마우스는 10 분 동안 대상 식품 하우스를 검색 할 수 있습니다.
- 스토P 비디오 추적.
- 중요! 빠른 살균제 각 시험 후 원형 접시와 음식의 주택을 청소합니다.
- (각 동물에 대한) 일곱 연속 일 동안 매일 테스트를 반복합니다.
- 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 결과 (대기 시간, 거리 적용 및 오류)를 분석합니다. 잘못된 음식 집 및 / 또는 입력하고 음식 펠릿 보상을 검색하지 않고 적절한 상자와의 접촉을 접근으로 오류를 정의합니다. 분류 분석을 위해 Bonferroni 사후 테스트를 양방향 ANOVA를 사용합니다.
- (선택 사항) 쥐를 희생하고 아래에 설명 된대로 해마를 분석합니다.
3. BrdU의 라벨링
- 삼일 (분화와 통합의 분석) 또는 단일 주사 (증식 분석) 200 ㎎ / ㎏ IP의 회 복강 내 50 ㎎ / ㎏의 IP가 BrdU를 주입.
- , 동물을 희생 해마를 해부 아래에 설명 된대로 40 μm의 섹션을 준비합니다.
- Denaturate10 분 동안 2 M HCl로 섹션 및 10 분 동안 0.1 M 보레이트 완충액 부화.
- BrdU의에 대한 항체를 사용하여 아래에 설명 된대로, 면역 조직 화학 염색을 각 동물에서 40 μm의 섹션 (떨어져 240 μM)의 1 인 12 개의 시리즈 레이블을 지정합니다.
- 과립 세포층과 subgranular 영역 rostrocaudal 범위에 걸쳐 공 촛점 현미경 분석에 의해 표지 된 세포를 정량화. DG 당 표지 세포의 수를 얻기 위해 두 가지에 의해 해마 및 분할 당 BrdU의 표지 세포의 예상 수를 얻기 위해 (12)에 의해 생성 된 숫자를 곱합니다.
4. 망막 비관 동물의 두뇌와 저온부의 제조 제거
- 동물을 안락사에 대한 로컬 승인 절차를 준수하십시오. 마우스는 직접 자궁 전위에 의해 안락사 할 수있다.
- (선택 사항) 동물 복강 인제에 의해 예를 들어, 지역 및 국제 가이드 라인에 따라 euthanization 전에 마취 할 수 있습니다(갓 식염수 나 생리 버퍼의 1.85 ㎖로 2.2 mg의 2,2,2 - tribromoethanol 이소 아밀 에탄올 ML 1에서 만든 150 ㎖의 원액을 혼합하여) 33g 마우스 0.8 ML Avertin의의의 ction.
- 베타 딘 (10 % 포비돈 요오드)을 적신 70 % 에탄올에 적신 거즈로 그 후 거즈와 면봉을 사용하여 머리를 소독.
- 적절한 수술 가위를 사용하여 동물의 목을 벨 옆 피부를 당겨.
- (OPTIONAL) Fixators 뒤로 지연된 피부의 접는 피하기 위해 적용될 수있다.
- 두개골의 중간 선 절개를 조심스럽게 옆으로 두개골 조각을 당기십시오.
- 조심스럽게 적절한 외과 용 기기 (예 : 모리아 스푼)를 사용하여 뇌 전체를 제거합니다.
- 드라이 아이스 -30 -40 ° C에서 50 ㎖ 비이커 (예 : Schott 쇼트 듀란)의 2 - 메틸 부탄의 Precool 25 ML.
참고 : 이상적으로 공 초점 레이저 주사 현미경에 적합하다 "두께"섹션의 자유 부동 염색의 경우, 뇌를 제거, 3 세척뇌 (보통 하룻밤) 아래로 아래로 침몰 할 때까지 인산 4 ° C에서 버퍼와 저장소에있는 시간은 50 ML 튜브에 30 % 자당 솔루션을 버퍼. - 조심스럽게 Nescofilm (파라 필름)의 조각에 뇌를 놓고 TissueTek의 OCT 화합물의 충분한 양 커버, -80 ° C에서 사용할 때까지 2 - 메틸 부탄, 저장소에 Nescofilm에 동결.
참고 : 9 % 자당, 7 mM의 MgCl2를, 50 mM의 인산염 완충액, 44 % 글리세롤에 -20 ° C 점에서 오랜 시간 보관하십시오. - 적절한 cryomicrotome에 10 ~ 12 μm의 두께 섹션으로 머리를 잘라.
참고 : 두께, 자유 부동 섹션의 경우 (예 : Reichert는 정, Frigomobil.) 및 -20 °에서 40 μm의 수평 부분을 잘라 적절한 cryotome의 cryotome 무대에서 뇌 동결 - 25 ° C. 미세 브러시와 나이프에서 섹션을 수집하고 버퍼에 수집하거나 장기간 저장을 위해 -20 ° C에서 (4.9 단계) 스토리지 솔루션을 유지. - 조심스럽게 하나의 현미경 슬라이드에 두 조각을 탑재합니다. 우리Superfrost UltraPlus 슬라이드 전자가 높은 부분의 접착 성을 극대화하는 것이 좋습니다.
- 실온에서 5 분간 슬라이드를 건조. 슬라이드를 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
5. 관류 동물에서 섹션의 준비
- (단계 8.4) 상술 한 바와 같이 동물을 마취.
- 조심스럽게 10 ~ 15 분 동안 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 다음 2 ~ 4 분 동안 인산염 완충 헤파린을 함유하는 생리 식염수 (PBS) (0.025 100g 당 ml의 PBS) 및 프로 카인 (0.5 100g 당 ml의 PBS)로 transcardially 동물을 perfuse . 관류 최적으로 약 1.2-1.4 m 또는 약 15 ㎖ / 분으로 설정 연동 펌프를 사용의 수압을 이용하여 좌심실과 우심방의 개방을 통해 관류에 의해 수행된다. 더 붉은 혈관이 눈에 보이는 것없는 그 창백한 흰색 두뇌에 최적의 관류 결과.
- 해부 및 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정.
- 극저온최소 24 시간 동안 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당의 머리를 보호합니다.
- cryotome 무대에서 머리를 고정.
- 적절한 cryotome를 사용하여 전체 forebrains에서 40 μm의 수평 섹션을 준비합니다.
- 슬라이드는 -20 ° C에서 사용할 때까지 동결 방지제 용액 (0.1 M 인산염 완충액, 50 % 글리세롤, 0.14 %의 MgCl2를 8.6 % 자당)에 저장 될 수 있습니다.
6. 망막 비관 동물의 뇌 섹션의 면역 조직 화학
- 10 분 동안 -20 ° C, 냉 메탄올을 사용하여, 전술 한 바와 같이 제조 저온부를 사후 고정한다.
- 4 ℃에서 하룻밤 (이차 항체를 제기에 사용 된 종) 0.3 % 트리톤-X를 포함하는 5 % 정상 혈청 차단
- 1X PBS로 3 회 세척하고 4 ℃에서 밤새 차 항체와 부화
- 1X PBS로 3 회 헹구 1 시간 동안 실온에서 이차 항체와 함께 배양한다.
- 1X PBS로 3 회 씻어
- 기SYTOX 녹색 또는 DAPI (또는 대안 DNA 염료)를 사용하여 DNA를위한 섹션 nterstain.
- 1X PBS로 3 회 씻어
- 수성 삽입 매체의 섹션을 포함합니다.
- 삽입 매체는 적어도 48 시간 동안 중합 보자.
7. 관류 동물의 뇌 섹션의 면역 조직 화학
- 단계 6.2에서 설명하고 이후 4 ℃에서 하룻밤 동안 0.3 % 트리톤-X (자유 부동)를 포함하는 PBS에 희석 차 항체 용액에 고정 된 뇌 부분을 품어로 차단
- 1X PBS로 3 회 헹군 후 3 시간 동안 실온에서 0.3 % 트리톤 X-(부동성)를 함유하는 PBS에 희석 차 항체 용액에 부화.
- 1X PBS로 3 회 씻어
- SYTOX 녹색 또는 DAPI (또는 다른 DNA 염료)를 사용하여 DNA에 대한 섹션을 Counterstain.
- 1X PBS로 3 회 씻어
- 수성 삽입 매체의 섹션을 포함합니다.
- 매립 매체에 대한 중합하자T 최소 48 시간.
8. 이끼 낀 섬유 계획 조사
- , 동물을 희생 상술 한 바와 같이 40 μm의 코로나 섹션을 준비하고 신경 미세 섬유 M.에 대한 항체를 사용하여 해마 부분을 얼룩
- 이끼 섬유와 핵을 시각화하는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 적절한 파장에서 섹션을 스캔. 낮은 배율에서 스캔을 시작합니다.
- 방향의 낮은 배율 이미지를 사용하여 이끼 섬유 돌기 해마를 대상으로.
- 높은 해상도와 높은 배율 섹션 (Z-절편)을 검사합니다.
- NF-M에 대한 염색을 통해 시각화 이끼 섬유의 형태 학적 모양과 연결을 분석합니다.
- (선택 사항) 해마 블레이드의 크기와 볼륨을 분석합니다. 측정을위한 DNA 신호를 사용합니다.
9. 플루오로 옥 C 분석 (신경 세포의 죽음)
- 동물을 희생 hippoc 해부ampus, 전술 한 바와 같이 12 μm의 섹션을 준비합니다.
- 섹션은 실온에서 30 분 동안 건조 시키십시오.
- 실온에서 40 분 동안 4 % PFA의 섹션을 고정한다.
- 간단히 섹션 DDH 2 O.와 배 세척
- 연속, 부드러운 흔들림에서 10 분 동안 0.06 % 과망간산 칼륨 (의 KMnO4)과 섹션을 품어.
- 섹션 DDH 2 O로 3 배 씻으
- 실온에서 20 분간 0.002 % 플루오로 옥 C 용액으로 섹션 부화.
- (옵션)을 동시에 핵 염색에 들어, 0.002 % 플루오로 옥 C 솔루션은 10 ㎍ / ㎖의의 DAPI로 보충 할 수있다.
- 간단히 섹션 DDH 2 O.와 배 세척
- 섹션은 실온에서 30 분 동안 건조 시키십시오.
- 크실렌과 섹션을 품어 (1 분)
- 크실렌 기반 설치 매체 (DPX)를 사용하여 섹션을 탑재합니다.
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Representative Results
IκB /의 교배 - 그리고 TTA 유전자 변형 마우스 라인은 해마에서 NF-κB 활성의 조건 억제에 이르게한다.
이중 형질 전환 마우스 (그림 1A)에서 IκBα-AA1-유전자의 발현을 조사하기 위해, 뇌 절연, 저온 절단 및 GFP (녹색 형광 단백질)에 대한 항체를 사용하여 염색 하였다. 공 초점 레이저 주사 현미경은 CA1과 CA3 지역에서 유전자의 고 발현을 공개하고, DG (그림 1B).
IκBα-AA1-유전자는 유형-2B 전구 세포로 표현하고, 중간 미성숙 한 상태에서 성숙한 과립 세포에서 활성화되어 있습니다.
해마 신경 인성 영역에서 CAMKIIα 중심 IκBα-AA1을 표현하는 최초의 세포 유형을 확인하려면, IκB / TTA 동물에서 해마의 저온부는 doublecortin에 염색(DCX)와 유전자 (GFP). 공 촛점 분석 CAMKIIα 활동에 의해 형질 전환 유전자 (그림 2, 화살표)의 발현 유도를 나타내는 젊은 DCX 양성 과립 세포에서 GFP-신호를 공개했다.
IκBα-AA1 통해 신경 세포의 NF-κB 억제 이끼 섬유 예측 및 두께와 DG의 볼륨을 줄일 수 있습니다.
IκB / TTA와 IκB /의 해마의 코로나 섹션 - 마우스는 이끼 섬유의 전망을 시각화하기 위해 신경 미세 섬유 M (NF-M)에 염색하고, 복잡하고 조직으로 다발 (그림 3)를 공개했다. IκB / TTA 마우스에서 이끼 섬유 돌기가 심하게 손상되었다. 또한, NF-κB의 억제는 크게 감소 suprapyramidal 블레이드 두께와 작은 DG 볼륨 (그림 3B)되었다.
IκB / TTA 마우스에서 NF-κB의 신경 세포 억제 상승의 연결 DEGEN로 연결.14 신경을 증가하고, DCX-표현 조상의 방해 마이그레이션.
신선한 극적인 구조적 결함에 대한 잠재적 인 이유를 연구하기 위해, IκB / TTA 마우스에서 고정되지 않은 해마 슬라이스는 신경 세포 죽음의 특정 검출 (그림 4A)를 할 수 있습니다 플루오로 옥 C로 염색 하였다. 여기에, 퇴화 신경 돌기의 극적으로 증가 수는 단일 유전자 제어에 비해 두 배 형질 전환 동물에서 관찰되었다. 또한, 절단 된 카스파 제 -3 - 긍정적 인 세포 사멸의 상당한 증가는 IκB / TTA 마우스에서 검출되었다. 대조적으로, DCX에 대한 면역 조직 화학 염색은 IκB / TTA 생쥐의 두뇌에서 DCX + 세포의 양을 증가 크게 나타났다. , 한층 IκB / TTA-해마에서 DCX + 세포 subgranular 영역에 배타적으로 배치되지 않았지만도 DG (도 4b)의 깊은 영역에서 발견 된 반면 DCX + 조상-IN 제어 동물 subgranular 영역 내에서 거의 독점적으로 현지화했다. DCX-발현하는 세포의 양이 증가 이전에 조상의 성숙 직접 인해 DCX + 세포의 증식에의 결과 인 경우 테스트하려면 BrdU의 그 다음 저온 절단 및 DCX와 염색 IκB / TTA 및 제어 생쥐의 해마,에 주입 및 BrdU의 (그림 4). 확산의 분석을 위해 BrdU의 24 시간 후 분석 하였다 (그림 4B, 계획 참조) 한 번 주입 하였다. 분화의 분석을 위해, 세 개의 주사는 칠일 후에 분석 하였다 매일 수행되었다. 세 가지 직렬 주사 - 접근 방식은 DG에서 BrdU의 / DCX + 세포의 명확 증가 된 양을 공개 반면 단일 BrdU를 주입 한 후, IκB/tTA-과 대조군 사이의 BrdU 양성 세포의 수에 유의 한 차이는 관찰되지 않았다 IκB / TTA 마우스의. 이것은 나타냅니다 방해 분화 나 DCX-EX의 통합눌러 세포는 DCX + 세포의 증가 된 숫자를 발생하고, 유형 3 세포가 참여했다 제안 수 있습니다.
심각한 학습 결함에서 NF-κB의 결과 신경 세포의 억제, 공간 패턴 분리 - 반스 미로 시험에 의해 입증으로. 특히 DG 의존 작업의 이중 형질 전환 마우스의 동작을 테스트하기 위해, 우리는 SPS-BM을 사용함으로써 동물 미묘한 차이가있는 곳 (그림 5)를 구별해야합니다. 이 행동 테스트에서, IκB / - 제어 동물 실험의 첫 날 (그림 5)에 직렬로 음식의 주택을 탐험. 교육 7 일 후, 동물을 직접 오픈 식품 집을 찾을 수 있었다. 대조적으로, IκB / TTA 동물도 훈련 (그림 5B) 후, 직렬 식품 집을 탐험을 계속했다. 덮여 거리에있는 상당한 증가, 높은 대기 시간 및 응급실의 관찰IκB / 비해 IκB / TTA 동물의 ROR 환율 - 제어 동물, 동물들이 심각한 학습 결손 (그림 5C)를 가지고하는 것이 좋습니다.
그림 1. NF-κB 활성의 조건부 전뇌 별 억제 세대. 성인 해마의 신경에서 NF-κB의 역할을 연구하는 데 사용되는 유전자 변형 모델의 A. 도식 그리기. 칼슘 - 칼 모듈 린 의존성 키나제 IIα (CAMKIIα) 발기인 중심의 테트라 사이클린 transactivator (TTA) 마우스는 녹색 형광 단백질과 결합 된 트랜스 지배적 부정적인 돌연변이 IκBa (IκB 생쥐 IκBa-AA1 슈퍼 억제)의 발현을 조절하는 데 사용 된 추적 (GFP). IκB / TTA 마우스에서 NF-κB는 비활성 역에서 세포질에 보관GFP 형광을 통해 검출 될 수 분해성 IκBa-AA1 의한 TE. 억제는 IκB / TTA 마우스 (CA1, CA3 및 DG)의 다른 해마 지역에서 TTA. B. 주제 유전자의 발현을 억제 독시사이클린 (doxycycline)에 의해 반전 될 수있다. 저온부는 IκB / 절연의 두뇌에서 제조되었다 -과 IκB / TTA 마우스 및 GFP에 대한 항체를 사용하여 고정 및 염색 하였다. 유전자가 매우 DG 내에서 표현합니다. 드 : 수상 돌기 DG : 치아 이랑 (dentate gyrus), ML : 분자 층, SL : 지층 lucidum의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. IκBa-AA1의 유전자가 표현되는 DCX 양성, 유형-2B의 progenit ORS 추가로 중간 상태에 성숙한 과립 세포에서 활성화됩니다. doublecortin (DCX) 염색 및 GFP 식 IκB / TTA 동물의 A. 저온 절단의 해마 젊은 DCX 양성 과립 세포 (화살표)에서 유전자의 발현을 알 수있다. DG : 치아 이랑 (dentate gyrus), ML : 분자 층 과립 세포 개발 과정에서 다양한 발달 단계에서 유전자 발현의 B. 도식 그리기.. IκBa-AA1-유전자 발현을 DCX 양성, 유형-2B 전구 세포, 모든 중간 미성숙 한 상태에서 성숙한 과립 세포에서 발견되었다. 대조적으로, (DCX 표현식 결여) 초기 유형 1 및 유형-2A 전구 세포 유전자를 발현하지 않았으며, 따라서, NF-κB 저해에 의해 영향을받지 않았다. Kempermann 등. 20 이후 수정 된 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. NF-κB의 억제는 단일 유전자 변형 제어 (IκB / -)에 비해 손상 이끼 섬유 예측하고 감소 DG 두께와 IκB / TTA 마우스에있는 볼륨에 이르게한다. 신경 미세 섬유 M (NF-M)를위한 저온 절단 된 해마의 A. 면역 염색 이끼 섬유의 전망을 시각화합니다. 제어 마우스에서 (IκB / -), CA3에서의 표적 세포에 과립 세포를 연결하는 이끼 섬유의 복잡으로 다발 조직은 IκB / TTA 마우스에서 NF-κB의 신경 억제 후 손상 한, 분명하다. 또한, 슈퍼 억제의 발현이 현저하게 감소 suprapyramidal 잎 간격 (왼쪽과 오른쪽 패널의 화살표 비교) 및 감소 DG 볼륨. B. 정량화 및 NF-κB의 억제로 인한 구조적 결함의 통계 분석에지도. 짝 t-검정, 두 개의 꼬리. 등 Imielski의 OA 버전에서 가져온 데이터는. 2 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. IκB / TTA 마우스에서 NF-κB의 억제는 신경 세포의 죽음, 강화 된 신경 및 DCX-발현하는 세포의 방해 철새 패턴을 증가로 연결됩니다. 컨트롤 - A. 신경 세포 특정 플루오로 옥 C 염색과 해마 부분의 절단 카스파 제 -3 - 양성 세포의 증가 숫자는 IκB /보다 IκB / TTA 생쥐의 신경 세포 죽음의 높은 수준을 보여준다. 퇴화 신경 돌기는 화살표로 표시되고, 핵은 별표로 표시됩니다. 오른쪽 사이트 : 절단 된 카스파 제 -3 - 포의 정량화해마 내 sitive 세포는 높은 이중 형질 전환 동물에서 세포 사멸을 증가 제안합니다. DCX에 대한 해마 저온부의 B. 염색은 이중 형질 전환 동물의 DCX-발현하는 세포 수의 증가를 보여준다. . 제어 C. - IκB / TTA-해마에있는 DCX + 세포가 subgranular 영역에서 독점적으로 배치하지만, IκB /보다 DG에 깊이 마이그레이션되지 않으므로주의 패널 왼쪽 :. 증식 유전자의 영향을 테스트하기를, 하나의 BrdU의 분사는 IκB / TTA와 컨트롤 사이의 BrdU 양성 세포의 수를 마우스 오른쪽 패널에 큰 차이가 날 렸습니다 수행 하였다 통계 평가는 의미를 밝혀 1 일 3 BrdU의 - 주사 후 IκB / TTA 동물의 DCX-발현하는 세포의 증가. 분석은 7 일 마지막 주사 (분화 및 통합 테스트) 후 시행 하였다. BrdU의 / DCX +의 상당한 증가는 I의 DG에서 발견되었다κB / TTA 마우스 (N = 3). 데이터는 부분적으로 Imielski 등. 2의 OA 버전에서 가져온 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 설정 및 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM)의 전형적인 결과. A. 왼쪽 : 실험 장치의 개략도 그림. 세븐 동일한 식품 주택 (같은 색상, 크기와 모양) 한 무료 자리 (시작 지점, S)와, 하드 불활성 플라스틱 (120cm의 직경)에서 내장 라운드, 집에서 만든 접시의 정의 장소에 대칭으로 배치했다. 여러 가지 빛깔 추가 - 미로 큐 (EMC)는 B의 동물, 약 100 cm에 쉽게 볼 위치에 흰색 색 천의 앞에 부착판의 순서. 냄새에 의해 방향을 방지하기 위해, 식품 알약은 모든 집에 보관하지만, 단 하나의 음식을 집 접근 (투명 호일로 만들어진 폐쇄)입니다됩니다. 오른쪽 : 그리고 여분의 미로 단서 SPS-BM 테스트 B. 일반적인 실험 결과를 포함하여 세트 업의 사진. : 비디오 카메라 플레이트 (115cm 플레이트까지의 거리)에 초점을 맞추었다. IκB / - 제어 동물 시험 시리즈의 첫 번째 날에 직렬 식품 주택을 탐구하고 열려있는 음식 집은 바로 교육 7 일 이후에 발견된다. 와 IκB / TTA 동물 -. 반면, IκB / TTA 쥐도 훈련 단계 IκB /에 SPS-BM 측정 매개 변수의 C. 비교 한 후 시리얼 탐사에 의해 입증으로 가난한 학습을 알 수있다. 이중 형질 전환 마우스는 상당한 기억력 결핍 쇼 (N = 9) 컨트롤 (N = 8) 지연에 대하여, 거리가 덮여 에러율과 비교. 양방향 ANOVA 평가, 오차 막대 : SEM. B의 데이터 및C는 등 Imielski의 OA 버전에서 촬영했다. 2 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성인 신경, 독시 싸이클린을 통해 신경 세포에서 NF-κB의 억제, 그 이후 재 활성화를 통해 그 조작의 가능성은 성인 뇌뿐만 아니라 신경 드 다시 세대에 신생아 뉴런에 수사 매혹적인 시스템을 제공합니다 . 이 시스템의 장점은 그 신경 세포의 죽음, 조상의 증식과 이동, 심각한 구조 및 해부학 적 변화뿐만 아니라, 명백한 학습 결함의 변화에 신경 결과뿐만 아니라에서 NF-κB 신호 전달 경로를 억제. 중요한 것은, IκB / TTA 동물의 표현형은 실험적으로 반전 독시사이클린의 투여 후 구조 될 수 있습니다. 표현형이 복귀 구조적 측면을 포함하고, 또한 DG 의존 2 학습에 상당한 개선으로 이어질 수 있습니다.
행동 실험에 대한 해석 결과를 보장하기 위해, 그것은 중요합니다 그 나이의 다른 작풍 만 수컷이하 4 일 이상의 후부가 사용 될 수있다. 또한, 모든 테스트는 일련의 동일한 오퍼레이터에 의해 수행되어야한다. 시험 장소에 관해서는, 우리는 강력하게 스트레스와 외부 노이즈 소스로부터 발생주의의 손실을 방지하기 위해 음향 절연 환경에서 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 대신 추가 - 미로 단서의 냄새 탐지에 따라 방향을 방지하기 위해 폐쇄 음식 집은 동물에 액세스 할 수 없도록하고, 일반 공기와 냄새 순환이 허용되어야한다. 또한, 시험에 사용되는 판은 냄새 중성 세제에 강한 소재로 내장되어야하며,주의 깊게 실험 사이에 청소해야합니다. 실험적인 변화의 또 다른 잠재적 인 소스는 실내 조명입니다. 광원은 이미지 수집, 추가 - 미로 신호를 인식 할 수 있도록 충분히 밝은해야하고, 비행 행동을 유도하지만, 동물의 눈을 멀게하는 강도이어야한다. 더욱이, 우리는 동시에 각각의 동물에 대한 테스트를 수행하는 건의일의주기 변화를 방지 할 수 있습니다.
뮤스 musculus는 시각적으로 눈에 띄는 기능 (나무와 같은 시각적 단서) (라담 등., 출원. 동물의 난연성. 과학. 86 (3 ~ 4에서 영토 경계를 감지하는 데 사용되는 다른 사람의 사이에서, 자연 조건에서, 상당히 좋은 비전 능력을 가지고 ), 261-289, 2004). 고전적인 실험 Balkema 등의. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982), 0 +6을 배치하고 -7 디옵터 마우스 눈 앞 렌즈와 망막 신경절 세포의 수용 필드 크기의 유의 한 변화를 관찰. 기한 필드 시각적 자극 (예를 들어, 추가 미로 큐)의이 거대한 깊이 마우스 앞 거리의 넓은 범위에 걸쳐 배치 될 수 있으며, 초점에 남아 있습니다. 우리의 접근에서, 시작점에서 추가 미로 큐의 거리는 문헌에 따른다 플레이트의 테두리 (30 ㎝였다 W의 예 140cm사연 등., 유전자 뇌의 난연성. 5 (5), 389-403, 2006)
설치류는 오픈 필드의 벽 부근에 유지하는 경향이있다. 이 문제는 thigmotaxis로 정의된다 (바넷, SH, 쥐 : 행동 연구, Aldline 출판, 시카고, PP 31 ~ 32, 1963). 최근 O`의심 많은 외 의해 연구. (Behav. 뇌 해상도. 216 (2), 531-542, 2011) C57BL/6J 마우스는 12 다른 쥐의 변종에 비해 반스 미로에서 더 나은 학습을 보여 주었다는 것을 보여 주었다. 64 %는 직렬 thigmotactic 전략을 사용하는 반면, 생쥐의 28 %가, 공간 검색을 사용 테스트했습니다. 이 데이터는 15cm 벽 주변에 69cm의 직경이 작은 미로에 대한 진정한 보유하고 있습니다. 그러나 마우스는 벽이없는 큰 미로 테스트 또는 단서를 intramaze, 우리의 설치 (120 μm의 직경)가 안정적으로 주로 추가 미로 시각적 단서를 사용합니다 (예를 들어, 바흐 등., 셀. 81 증거를 보여 주었다으로 예를 들어, 미세 구조의 차이로 인해 더 물리적 인 신호를 방지하기 위해 판은 각 실험 후 회전했다.
행동 검사는 단순히 적절한 마우스 모델을 사용하여, 성인 해마 신경 다른 전사 인자의 영향을 조사하기 위해 적응 될 수있다. 그러나, 주로 DG 의존 학습 (공간 패턴의 분리)를 테스트하기 위해 설계 및 신경이나 다른 뇌 영역에서 신경 세포의 변성의 조사는 적절하지 않을 수 있습니다. 이러한 관점에서, SPS-BM의 사용은 더 이상의 DG-특이성 (EC II 및 DG 및 CA3과 CA1 및 EC VI 사이 기능 회로에 엄격한 의존성), 따라서 관련된 태스크를 조사 적용되지 않아야 의해 제한된다 monosynaptic EC III - CA1 - EC V - 회로.
여기에 설명 된 방법의 미래의 어플리케이션은 줄기 세포 이식, pharmaceu의 효과를 조사 포함해마 내에 성인 해마 신경 및 조직의 항상성에 tical 치료.
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Disclosures
저자는 이익에 대한 갈등이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원 안젤라 Kralemann - 쾰러 감사합니다. 여기에 기술 된 실험 연구는 실험실에서 수행되었으며, CK 및 BK와 BK에 대한 연구 및 교육의 독일 교육부 (BMBF)의 부여에 독일 연구 협회 (DFG)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-Doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | IHC, Dilution 1:2,000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2,000 |
| Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | Mundipharma | D08AG02 | disinfectant |
| Cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120 cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke Mayr | 113 911 | disinfectant |
| Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | TSE Systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilization/IHC |
| Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40 µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro-Jade C staining |
References
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