El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.
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Artículo de método
Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto
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Resumen
Resumen
La deficiencia visual y la ceguera debidas a la pérdida de las células sensoras de luz de la retina, es decir, los fotorreceptores, representan la principal razón de discapacidad en los países industrializados. El reemplazo de fotorreceptores degenerados por el trasplante de la célula representa una opción posible del tratamiento en usos clínicos futuros. De hecho, los estudios preclínicos recientes demostraron que los fotorreceptores inmaduros, aislados de la retina neonatal del ratón en el día postnatal 4, tienen el potencial de integrarse en la retina adulta del ratón después del trasplante subretinal. Las células dispensadoras de aceite generaron una morfología madura del fotorreceptor incluyendo segmentos internos y externos, un cuerpo de la célula redonda situado en la capa nuclear externa, y terminales sinápticos en gran proximidad a las células bipolares endógenas. De hecho, informes recientes demostraron que los fotorreceptores donantes se integran funcionalmente en los circuitos neuronales de los ratones huésped. Para un uso clínico futuro de tal acercamiento del reemplazo de la célula, las suspensiones purificadas de las células de la opción tienen que ser generadas y ser colocadas en la posición correcta para la integración apropiada en el ojo. Para el enriquecimiento de los precursores de fotorreceptores, la clasificación debe basarse en antígenos específicos de la superficie celular para evitar la modificación genética de las células donantes. Aquí mostramos la clasificación de células asociadas magnéticas (MACS) - enriquecimiento de precursores de fotorreceptores de varilla trasplantables aislados de la retina neonatal de ratones reporteros específicos de fotorreceptores basados en el marcador de superficie celular CD73. La incubación con los anticuerpos anti-CD73 seguidos por los anticuerpos secundarios conjugados micro-grano permitió el enriquecimiento de los precursores del fotorreceptor de la barra por los MACS al aproximadamente 90%. En comparación con la citometría de flujo, macs tiene la ventaja de que puede ser más fácil de aplicar a los estándares GMP y que altas cantidades de células se pueden clasificar en períodos de tiempo relativamente cortos. La inyección de suspensiones de células enriquecidas en el espacio subretinal de ratones adultos de tipo salvaje resultó en una tasa de integración 3 veces mayor en comparación con las suspensiones celulares no clasificadas.
Introducción
La visión es uno de los principales sentidos de los seres humanos. El deterioro de este sentido y la ceguera son una de las principales razones de la discapacidad en los países industrializados. La causa predominante para la debilitación de la visión o la ceguera es la degeneración retiniana, caracterizada por la pérdida de la célula del fotorreceptor, pues puede ser observada en la degeneración macular, el pigmentosa de la retinitis, la distrofia de la cono-barra, y otras condiciones. Hasta la fecha, una terapia eficaz para restaurar la visión perdida no está disponible. En 2006 y 2008 dos laboratorios diferentes reportaron, independientes entre sí, un trasplante exitoso de células precursoras de fotorreceptores de varilla en retinas adultas de ratones de tipo salvaje1,2. Así, surge la posibilidad de trasplante de células precursoras de fotorreceptores también en una retina degenerada, para reemplazar los fotorreceptores degenerados y restaurar la visión. De hecho, se ha demostrado recientemente, que tales células precursoras de fotorreceptores trasplantados provocan criterios morfológicos de fotorreceptores maduros de tipo salvaje, como segmentos externos correctamente desarrollados3,terminales sinápticos en estrecha proximidad a las células bipolares endógenas y un cuerpo de células redondas situado en la capa nuclear externa2-4,así como la capacidad de integrarse funcionalmente en los circuitos neuronales del huésped5-7. Uno de los principios fundamentales de esta estrategia es el uso de retinas de ratones jóvenes postnatales de día 4 (PN 4, PN0 se define como día de nacimiento), lo que resulta en una mezcla de diferentes tipos de células para trasplante. En el fondo de una futura aplicación terapéutica, esta mezcla tiene que ser purificada para las células precursoras de fotorreceptores. CD73 se ha descrito como el primer marcador de superficie celular específico para fotorreceptores jóvenes en la retina8-10. Aquí, se demuestra un método de purificación de células precursoras de fotorreceptores basado en este marcador de superficie celular y con el uso de la técnica de clasificación de células asociadas magnéticamente (MACS). Macs podría tener ventajas en comparación con las técnicas de clasificación de células activadas por fluorescentes, debido a los tiempos de clasificación rápidos y el ajuste más fácil a las condiciones GMP. Podríamos demostrar un enriquecimiento del ~90% y un índice más alto de la integración del hasta 3 dobleces al trasplantar la población enriquecida al espacio subretinal en el salvaje-tipo adulto retinas. Así, el enriquecimiento macs-basado de la célula del precursor del fotorreceptor y el trasplante subretinal, son técnicas confiables y prometedoras para el desarrollo de una estrategia terapéutica regenerativa para el tratamiento de la degeneración retiniana.
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Protocolo
Declaración de uso ético y cuidado de los animales:
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las leyes de la Unión Europea y Alemania (Tierschutzgesetz) y se adhirieron a la Declaración arvo para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la TU Dresden y la Landesdirektion Dresden (número de aprobación: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Antes de iniciar la disociación de celdas y la clasificación de celdas
- Etiquete tres tubos de reacción de 15 ml con: Lavado (W), Fracción positiva (+) y Fracción negativa (-).
2. Disociación de la retina
- Decapitar los cachorros PN 4 usando una tijera.
- Enjuague la cabeza de las crías en breve en etanol al 70% seguido de lavado en PBS.
- Transfiera la cabeza a HBSS frío y enuclee el ojo (repita este paso para todas las cabezas). Para enuclear, abra los párpados y fije el ojo con fórceps curvos en la región del nervio óptico. A continuación, tire del ojo con cuidado fuera de la órbita.
- Después de enucleating todos los ojos, aislar la retina: introducir una tijera cerrada en el nervio óptico y abrir las cuchillas. Peal el RPE/chorid hacia fuera. Retire las lentes y los vasos sanguíneos con fórceps curvos.
- Transfiera las retinas aisladas a un tubo de reacción de 1,5 ml que contenga la solución de papaína (proporcionada por el kit de disociación de papaína).
- Incubar las retinas en la solución de papaína durante 30-60 min en un baño de agua o agitadora (400 rpm) a 37 °C.
- Mientras las retinas se incuban en la solución de papaína, pipetear 1 ml de solución ovomucoide a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "1").
- Añadir 60 μl de DNasa I (10 mg/ml) + 60 μl de solución ovomucoide (proporcionada por el kit) + 520 μl de EBSS a un tubo de reacción de 15 ml (etiqueta "2").
- Después de la incubación de la papaína, transferir la solución de papaína que contiene las retinas parcialmente digeridas al tubo de reacción "2".
- Utilizando una pipeta pulida contra fuego, realizar la disociación mecánica (10x arriba y abajo).
- Pipetear la suspensión unicelular al tubo de reacción "1". Trate de generar 2 capas colocando suavemente la suspensión celular en la parte superior de la solución ovomucoide.
- Centrífuga durante 5 min a 300 x g (aproximadamente 1.300 rpm).
- Deseche el sobrenadante y resuspend las células en 500 μl de buffer MACS.
3. Clasificación de celdas mediante clasificación de celdas asociadas magnéticas (MACS)
- Añadir X μl de anticuerpo anti-CD73 de rata a los 500 μl para lograr una concentración final de 10 μg/ml.
- Incubar 5 min sobre hielo.
- Llene el tubo de reacción de 15 ml a 10 ml con tampón MACS y centrífugalo durante 5 min a una velocidad de 300 x g.
- Retire el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en 480 μl macs buffer y añadir 120 μl de cabra anti-rata IgG microperlas.
- Incubar 15 min sobre hielo; no agitarlo, agitarlo ni mezclarlo.
- Llene el tubo de reacción de 15 ml a 5 ml con tampón MACS y centrífugalo durante 5 min a 300 x g.
- Como el tubo de reacción se centrifuga:
- Ajuste una columna LS en el soporte magnético.
- Coloque el filtro de preseparación encima de la columna LS.
- Hidrate el filtro de preseparación y la columna LS con tampón MACS de 3 ml y recoja el tampón MACS en el tubo de lavado (W).
- Retire el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en 500 μl macs tampón.
- Cargue la suspensión de celda de 500 μl en el filtro, luego agregue un tampón MACS de 1 ml al filtro y recoja la fracción negativa en el tubo de reacción de fracción negativa (-).
- A continuación, agregue 3 x 3 ml de búfer MACS a la columna para lavar las celdas que no están unidas a la columna
- Una vez que estos 9 ml estén a través de la Columna LS, retire la columna del soporte magnético e instálela encima del tubo de reacción de fracción positiva (+).
- Cargue rápidamente 5 ml de búfer MACS en la columna LS y coloque el émbolo en la columna LS y presione hacia abajo hasta que todo el búfer esté a través de la columna.
- Centrifugar el tubo de reacción que contiene la fracción positiva durante 5 min a 300 x g.
- Retire el sobrenadante, resuspend en 500 μl de tampón MACS y manténgalo a 4 °C.
- Cuente la cantidad total de celdas que utilizan un dispositivo de recuento de celdas común.
- Preparar una suspensión celular a partir de la fracción clasificada positiva que contenga 2 x 105 células/μl en tampón MACS y conservarla a 4 °C
4. Trasplante de células precursoras de fotorreceptores clasificadas por MAC en la retina del ratón
- Asegúrese de tener todas las siguientes soluciones listas: 1 ml de PBS estéril o HBSS, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml de H2O desionizado estéril, alícuotas de las fracciones de suspensión celular a 4 °C.
- Anestesiar el ratón adulto(es decir, 2-4 meses de edad) con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), ketamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Luego haga una inyección subcutánea de buprenorfina (0.05 mg/kg de peso corporal) para aliviar el dolor.
- Dilatar las pupilas con una gota de Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5%.
- Fije el ratón en el soporte de la cabeza del ratón y colótelo bajo microscopio estéreo.
- Aplique una gota de gel visídico para evitar el secado del ojo.
- Hacer un pequeño agujero en el borde entre esclerótica y córnea (respectivamente ora serrata)usando un estéril 30 G 1/2 en aguja.
- Corte un portaobjetos de cubierta común en piezas pequeñas (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando una pluma de diamante, coloque una de estas piezas en la parte superior de la córnea, permitiendo la visualización directa de la retina.
- Enjuague la jeringa de microlitro presterilizada varias veces con agua desionizada.
- Cargue la jeringa de microlitro con 1 μl de suspensión celular, dirija la aguja tangencialmente a través de la conjuntiva y la esclerótica y colóquela bajo control visual en la mitad nasal de la retina.
- Perforar suavemente un agujero en la retina hasta llegar al espacio subretinal, inyectar la suspensión celular en el espacio subretinal.
- Observe el desprendimiento bullar de retina, que debe ser uniforme, cubriendo aproximadamente 1/4 del espacio retiniano sin ningún sangrado.
- Retire la jeringa suavemente, el agujero de la retina se sella automáticamente.
- Enjuague la jeringa del microlitro varias veces con agua desionizada.
- Suelte el ratón del soporte de la cabeza.
- Despertar el ratón mediante la inyección de clorhidrato de atipamozol para la reversión del efecto de clorhidrato de medetomidina.
- Coloque el ratón para la hora de despertar en una cámara oscura cálida (aproximadamente 25 °C).
- Los próximos 2 días después del trasplante, la buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) debe administrarse mediante inyección subcutánea por la mañana y por la tarde para aliviar el dolor.
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Resultados
Con el fin de evaluar la capacidad de los fotorreceptores de varilla para integrarse en la retina del ratón, se utilizó una línea de reportero de ratón, en la que la GFP es impulsada por el promotor de la cremallera de leucina de la retina neural (Nrl, Nrl-GFP)11. Nrl es el marcador más temprano de fotorreceptores de varilla que comienza su expresión en E12.5 a lo largo de la edad adulta, lo que permite un etiquetado específico de las células fotorreceptoras de varilla donante.
Los ...
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Discusión
El trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores representa una herramienta confiable para lograr la integración de estas células sensibles a la luz en las retinas del huésped en números significativos1,2. Esto podría permitir el establecimiento de una terapia celular para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en el futuro6. La población donante de células, actualmente aislada de las retinas PN 4, es una mezcla de diferentes tipos de células, de las que sólo las células precursora...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gusta agradecer a Anand Swaroop por proporcionar ratones Nrl-GFP, Jochen Haas por soporte técnico y Sindy Böhme y Emely Lessmann por la cría de animales.
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, el CRTD Seed Grant Program, el SFB 655 y el ProRetina e.V. fundación, el DIGS-BB Graduate Program Dresden, y la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de disociación de papaína | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | suministrada La DNasa I no se utiliza en el método |
| Anti-ratón purificado CD73, clon TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Concentración de existencias 0,5 mg/ml |
| Cabra Anti-Rata IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Volumen total de 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Se utiliza para contar el número total de células |
| DNasa I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Se utiliza para la disociación de las retinas |
| Azul de tripán | Sigma | Fluka93595 | Se utiliza para contar el número total de células |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamina 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Fenilefrina 2.5%-Tropicamid 0.5% | Clínicas Universitarias Dresden Farmacia | ||
| Filtros de preseparación | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columnas | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Separador QuadroMACS | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Vidrio pulido al fuego Pipeta Pasteur | Marca | 74777 20 | La pipeta' Las puntas deben pulirse al fuego y esterilizarse en autoclave. |
| Gradilla de tubos MACS de 15 ml | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cámara de recuento de células | Carl Roth | T728.1 | |
| Tubos estériles de 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | en lugar de Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | en | lugar de Leica M651 MSD | |
| Microscopio estereoscópico invertido Olympus CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Campana de cultivo celular Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1,5 ml Tubo de reacción | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Tubo de reacción | Sarstedt | 72695 | |
| Centrífuga Eppendorf 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Soporte para cabeza de ratón | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 en | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton jeringa de microlitros 5 µ l, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | entregado sin agujas |
| Hamilton RN aguja especial 34 G | Hamilton | 065-207434 | romo, 12 mm |
| de longitud Vannas-Tü Tijeras de resorte bingen - 5 mm Hojas rectas | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Pinzas Dumont #7 - Titanio Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Bolígrafo de diamante | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cubreobjetos | Sparks | MIC3366 |
Referencias
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