Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto

Resumen

El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.

Resumen

La deficiencia visual y la ceguera debidas a la pérdida de las células sensoras de luz de la retina, es decir, los fotorreceptores, representan la principal razón de discapacidad en los países industrializados. El reemplazo de fotorreceptores degenerados por el trasplante de la célula representa una opción posible del tratamiento en usos clínicos futuros. De hecho, los estudios preclínicos recientes demostraron que los fotorreceptores inmaduros, aislados de la retina neonatal del ratón en el día postnatal 4, tienen el potencial de integrarse en la retina adulta del ratón después del trasplante subretinal. Las células dispensadoras de aceite generaron una morfología madura del fotorreceptor incluyendo segmentos internos y externos, un cuerpo de la célula redonda situado en la capa nuclear externa, y terminales sinápticos en gran proximidad a las células bipolares endógenas. De hecho, informes recientes demostraron que los fotorreceptores donantes se integran funcionalmente en los circuitos neuronales de los ratones huésped. Para un uso clínico futuro de tal acercamiento del reemplazo de la célula, las suspensiones purificadas de las células de la opción tienen que ser generadas y ser colocadas en la posición correcta para la integración apropiada en el ojo. Para el enriquecimiento de los precursores de fotorreceptores, la clasificación debe basarse en antígenos específicos de la superficie celular para evitar la modificación genética de las células donantes. Aquí mostramos la clasificación de células asociadas magnéticas (MACS) - enriquecimiento de precursores de fotorreceptores de varilla trasplantables aislados de la retina neonatal de ratones reporteros específicos de fotorreceptores basados en el marcador de superficie celular CD73. La incubación con los anticuerpos anti-CD73 seguidos por los anticuerpos secundarios conjugados micro-grano permitió el enriquecimiento de los precursores del fotorreceptor de la barra por los MACS al aproximadamente 90%. En comparación con la citometría de flujo, macs tiene la ventaja de que puede ser más fácil de aplicar a los estándares GMP y que altas cantidades de células se pueden clasificar en períodos de tiempo relativamente cortos. La inyección de suspensiones de células enriquecidas en el espacio subretinal de ratones adultos de tipo salvaje resultó en una tasa de integración 3 veces mayor en comparación con las suspensiones celulares no clasificadas.

Introducción

La visión es uno de los principales sentidos de los seres humanos. El deterioro de este sentido y la ceguera son una de las principales razones de la discapacidad en los países industrializados. La causa predominante para la debilitación de la visión o la ceguera es la degeneración retiniana, caracterizada por la pérdida de la célula del fotorreceptor, pues puede ser observada en la degeneración macular, el pigmentosa de la retinitis, la distrofia de la cono-barra, y otras condiciones. Hasta la fecha, una terapia eficaz para restaurar la visión perdida no está disponible. En 2006 y 2008 dos laboratorios diferentes reportaron, independientes entre sí, un trasplante exitoso de células precu....

Protocolo

Declaración de uso ético y cuidado de los animales:

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las leyes de la Unión Europea y Alemania (Tierschutzgesetz) y se adhirieron a la Declaración arvo para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la TU Dresden y la Landesdirektion Dresden (número de aprobación: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Antes de iniciar la disociación de celdas y la clasificación de celdas

1. Etiquete tres tubos de reacción de 15 ml con: Lavado (W), F....

Resultados

Con el fin de evaluar la capacidad de los fotorreceptores de varilla para integrarse en la retina del ratón, se utilizó una línea de reportero de ratón, en la que la GFP es impulsada por el promotor de la cremallera de leucina de la retina neural (Nrl, Nrl-GFP)^11. Nrl es el marcador más temprano de fotorreceptores de varilla que comienza su expresión en E12.5 a lo largo de la edad adulta, lo que permite un etiquetado específico de las células fotorreceptoras de varilla donante.

Los .......

Discusión

El trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores representa una herramienta confiable para lograr la integración de estas células sensibles a la luz en las retinas del huésped en números significativos^1,2. Esto podría permitir el establecimiento de una terapia celular para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en el futuro⁶. La población donante de células, actualmente aislada de las retinas PN 4, es una mezcla de diferentes tipos de células, de las que sólo las células precursora.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de disociación de papaína	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	suministrada La DNasa I no se utiliza en el método
Anti-ratón purificado CD73, clon TY/23	BD Pharmingen	550738	Concentración de existencias 0,5 mg/ml
Cabra Anti-Rata IgG MicroBeads	Miltenyi	130-048-501	Volumen total de 2 ml
PBS	Gibco	10010-015	Se utiliza para contar el número total de células
DNasa I	Sigma	D5025-150KU
HBSS	Gibco	14025050	Se utiliza para la disociación de las retinas
Azul de tripán	Sigma	Fluka93595	Se utiliza para contar el número total de células
Vidisic	Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor	Pfizer	76579
Ketamina 10%	Ratiopharm	7538843
Antisedan	Pfizer	76590
Fenilefrina 2.5%-Tropicamid 0.5%	Clínicas Universitarias Dresden Farmacia
Filtros de preseparación	Miltenyi	130-041-407
LS Columnas	Miltenyi	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303
Separador QuadroMACS	Miltenyi	130-090-976
Vidrio pulido al fuego Pipeta Pasteur	Marca	74777 20	La pipeta' Las puntas deben pulirse al fuego y esterilizarse en autoclave.
Gradilla de tubos MACS de 15 ml	Miltenyi	130-091-052
Cámara de recuento de células	Carl Roth	T728.1
Tubos estériles de 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Leica M651 MSD	Leica	M651 MSD	en lugar de Olympus SZX10
Olympus SZX10	en		lugar de Leica M651 MSD
Microscopio estereoscópico invertido Olympus CKX41	Olympus	CKX41
Campana de cultivo celular Thermo Scientific MSC-Advance	Thermo Scientific	51025411
1,5 ml Tubo de reacción	Sarstedt	727706400
2 ml Tubo de reacción	Sarstedt	72695
Centrífuga Eppendorf 5702	VWR (Eppendorf)	521-0733
Soporte para cabeza de ratón	myNeurolab	471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 en	BD Pharmingen	304000
Hamilton jeringa de microlitros 5 µ l, 75RN	Hamilton	065-7634-01	entregado sin agujas
Hamilton RN aguja especial 34 G	Hamilton	065-207434	romo, 12 mm
de longitud Vannas-Tü Tijeras de resorte bingen - 5 mm Hojas rectas	Fine Science Tools	15003-08
Pinzas Dumont #7 - Titanio Biologie	Fine Science Tools	11272-40
Bolígrafo de diamante	Tools-tech
15 mm x 15 mm Cubreobjetos	Sparks	MIC3366

Se puede utilizar Se puede utilizar