En los métodos de cultivo estándar se toman células de su entorno fisiológico y se hicieron crecer en la superficie de plástico de un plato. Para estudiar el comportamiento de las células de médula ósea humana primaria hemos creado un sistema de cultivo de 3-D, donde las células se cultivan en condiciones que recapitulan el microambiente nativo del tejido.
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Artículo de método
Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades
En este artículo
Resumen
Resumen
El cultivo de tejidos ha sido una herramienta muy valiosa para estudiar muchos aspectos de la función celular, desde el desarrollo normal a la enfermedad. Métodos de cultivo celular convencionales se basan en la capacidad de las células ya sea para unirse a un sustrato sólido de una placa de cultivo de tejido o para crecer en suspensión en medio líquido. Múltiples líneas celulares inmortales se han creado y crecido utilizando estos enfoques, sin embargo, estos métodos a menudo fallan cuando las células primarias necesitan ser cultivadas ex vivo. Dicha avería se ha atribuido a la ausencia de los componentes de la matriz extracelular apropiadas del microambiente del tejido de los sistemas estándar que se utiliza plástico de cultivo de tejidos como una superficie para el crecimiento celular. La matriz extracelular es un componente integral del microambiente del tejido y su presencia es crucial para el mantenimiento de las funciones fisiológicas tales como la polarización celular, la supervivencia y la proliferación. Aquí presentamos un método de cultivo de tejidos de 3 dimensiones donde cel hueso medular primariaLS se cultivan en matriz extracelular formulado para recapitular el microambiente de la médula humana (sistema de RBM). Incrustado en la matriz extracelular, las células se suministran con nutrientes a través del medio suplementado con plasma humano, proporcionando así un sistema integral donde la supervivencia y la proliferación celular se puede mantener durante hasta 30 días, mientras que el mantenimiento de la composición celular del tejido primario. Usando el sistema de gestión por resultados que hemos crecido con éxito células de médula ósea primarias de donantes sanos y en pacientes con amiloidosis, y diversas neoplasias hematológicas. El sistema de GBR permite, visualización directa en-matriz en tiempo real del comportamiento celular y evaluación de la eficacia preclínica de nuevas terapias. Por otra parte, las células se pueden aislar de la GBR y posteriormente utilizados para el trasplante in vivo, clasificación de células, citometría de flujo, y el ácido nucleico y el análisis de proteínas. En su conjunto, el método de gestión por resultados proporciona un sistema fiable para el crecimiento de huesos primario marrocélulas W en condiciones fisiológicas.
Introducción
El cultivo de tejidos se ha desarrollado para estudiar el comportamiento de células en un entorno controlado para minimizar la variabilidad sistémica cuando la comparación de diversos procesos en organismos intactos. Este método se estableció por primera vez en el 1900 y 1,2 se refiere a una técnica en explantes de tejidos fueron cultivadas ex vivo en un plato de cristal. A mediados de la década de 1900 el sistema fue adaptado para hacer crecer células dispersas en lugar de fragmentos de tejidos intactos, y los términos "cultivo de tejidos" y "cultivo celular" se convirtió en sinónimo de 3. En tales sistemas de cultivo celular convencio....
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Protocolo
1. Anticipo para la Preparación
- Mantenga pipetas serológicas estériles y puntas de pipeta a 4 ° C.
Solución de problemas: geles de Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizando pipetas fríos y consejos evitarán Matrigel gelifique durante la configuración de la cultura. - Descongelar una botella de Matrigel en 4 ° C durante la noche.
2. Preparación de los reactivos
- Preparación de la solución de fibronectina existencia: Haga una solución de 1 mg / ml de fibronectina disolviendo 100 mg de fibronectina humana en 100 ml de agua destilada. Una vez que la fibronectina se ha disuelto,....
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Resultados
Dado que las células de médula ósea primaria fallan a proliferar en condiciones de cultivo de tejidos estándar, el sistema de GBR se ha creado para imitar el microambiente de la médula, proporcionando un sistema para la cultura y expandir las células BM ex vivo. Los principales componentes de la matriz extracelular BM, fibronectina, colágeno I, colágeno IV, laminina y 21, se incorporaron a la matriz RBM para proporcionar el andamiaje estructural de esta cultura 3-D. Endostio, la interfaz entre el hue.......
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Discusión
El modelo de gestión por resultados proporciona un sistema integral donde la composición celular del BM se mantiene ex vivo por hasta 30 días. BM células cultivadas en la auto-estratificar RBM según su función imitando de cerca la arquitectura BM encontrado in vivo. Por otra parte, este es el primer sistema que permite la expansión del clon mieloma múltiple 8. Los pasos más importantes para garantizar el sólido crecimiento de las células de BM y el éxito general de la cultura son: 1) para ob.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer (1R21CA141039), BD Premio Beca de Investigación de Biociencias, la Sociedad Americana del Cáncer Investigación Institucional Grant (IRG # 58-006-53), al Centro de la Universidad de Purdue para el cáncer Investigación y los Institutos Canadienses de la Programa de Iniciativas de Investigación del Cáncer de Alberta Junta de Investigación y Salud. MP fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, Programa de Prácticas de Prevención del Cáncer (R25CA128770; PI: D. Teegarden), administrado por el Centro de Ciencias Oncológicas y el....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de proliferación CellTrace CFSE-para citometría de flujo | Invitrogen/Life Technologies | C34554 | |
| Fibronectina de plasma humano | Millipore | NG1884448 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Lifesciences | 17-1440-02 | |
| Matrigel matriz de membrana basal | BD Biosciences | 354234 | |
| Cola de rata colágeno tipo I | BD Biosciences | 354249 | Colágeno I de Millipore no se polimeriza correctamente utilizando este protocolo |
| Medio de montaje VECTASHIELD para fluorescencia (conjunto regular) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX comprimidos Sigma-Aldrich | F4648 | Para tinción TRAP | |
| SigmaFast BCIP/NBT comprimidos Sigma-Aldrich | B5655 | Para tinción con fosfatasa alcalina | |
| Microscopio confocal Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss Zeiss | ||
| 510 software | Carl Zeiss Software de análisis de | imágenes para análisis confocal | |
| Microscopio invertido Zeiss Axiovert 200M | Carl Zeiss | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | Software de análisis de imágenes para Axiovert 200M | |
| FACSotómetro de flujo de orto | Software CellQuest Pro de BD Biosciences | ||
| BD Biosciences | Software para el análisis de datos de citometría de flujo |
Referencias
- Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
- Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
- Earle, W. R.
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Reimpresiones y permisos
